姜 娜， 唐 敏， 韓 博， 任 健， 許文花， 畢玉芬*， 馬向麗*

(1. 云南農業(yè)大學動物科學技術學院， 云南 昆明 650201； 2. 云南農業(yè)大學園林園藝學院， 云南 昆明 650201)

苜蓿是我國最重要的豆科牧草，其種植面積廣、適應性強、產草量高，并且含有豐富的營養(yǎng)物質，有著“牧草之王”的美譽[1]。云南20世紀80年代開始試種紫花苜蓿，僅1983年便從澳大利亞引進了苜蓿屬飼草資源9個種，共計99份品種和資源，隨后云南牧草工作者也陸續(xù)引入了大量的紫花苜蓿(Medicagosativa)品種[2]。但由于云南多為酸性土壤，鋁毒害較為嚴重，導致這些資源沒有得到大面積推廣。隨著紫花苜蓿引種和推廣工作的開展，部分苜蓿資源零散生存且被保留下來，成為適用于選育耐鋁性苜蓿的重要材料。本課題組前期對這些苜蓿資源進行了適生性和遺傳多樣性的研究[3-6]，但有關耐鋁性紫花苜蓿材料的篩選以及綜合影響評價報道較少。

植物的鋁毒效應外在形態(tài)表現(xiàn)主要是根系和地上部分生長受阻。周蓉、孫文君等[7-10]研究表明，長時間鋁脅迫可抑制植物的根系生長，導致根系活力下降。植物生理指標在一定程度上也反映植物在鋁脅迫下的耐受性。大量研究表明，脯氨酸含量積累的多少在一定程度上反映了植物的抗逆性。在逆境條件下植物體往往會大量積累脯氨酸，積累的脯氨酸可降低細胞滲透勢，維持壓力勢，保持和穩(wěn)定大分子物質，參與葉綠素合成，維持細胞膜正常功能，并且一般情況下耐性的品種會積累較多的脯氨酸[11]。鋁脅迫下植物根系分泌有機酸也是植物耐鋁的一種重要的機理，是近年來國內外植物抗鋁研究的熱點[12]。Ryan等在同一條件下調查了 36 種耐鋁能力不同的小麥品種，結果發(fā)現(xiàn)，根系分泌的蘋果酸數(shù)量與這些品種對鋁的忍耐程度間存在高度的相關性[13]。Miyasaka等發(fā)現(xiàn)，鋁脅迫下菜豆耐鋁品種根系分泌的檸檬酸比敏感品種高10倍[14]。大量的文獻證據表明，鋁脅迫下有機酸的分泌能夠螯合AL3+，在降低其生物毒性方面具有重要作用。在眾多的耐鋁毒機制中，有機酸的分泌被認為是植物耐鋁毒評價最重要的機制。但這些研究多集中于大作物，如小麥、玉米、水稻等，而牧草上尤其苜蓿上少有研究。

本研究采用形態(tài)學和生理學的方法，參照課題組前期研究結果，選取前期研究的三個鋁濃度中最高鋁濃度(100 mg·kg-1)，對27份云南紫花苜蓿資源的耐鋁性進行評價，進一步鑒定和篩選出耐鋁性強的苜蓿材料，為選育能夠廣泛適應云南大面積酸性土壤區(qū)種植的苜蓿品系提供種質資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料收集和野外調查的方法

材料收集和生態(tài)調查參照白史且的[15]方法。以2007～2008年對滇西北、滇中、滇東、滇南地區(qū)收集的紫花苜蓿資源為研究材料[16]。

表1 27份云南逸生苜蓿材料的采集地點Table 1 Collection areas of 27 escaped alfalfa in Yunnan

1.2 培養(yǎng)及處理

栽培方法：用干凈的細沙做基質，細沙用去離子水處理后烘干備用。選用容積為600 mL的塑料盆，并在塑料盆底部鋪上與其底面積一樣的無紡布，取生長一致、健康的生根苗經0.1%HgCl2消毒10 min，沖洗干凈后均勻種于細沙中，再輕輕覆蓋50 g細沙。每隔4～5 d澆Hoagland營養(yǎng)液。培養(yǎng)20 d，期間注意保持溫室的通風，溫度和濕度恒定，定期噴農藥除蟲除雜草。

鋁處理：將營養(yǎng)液的pH調整為4.5，選用三價硝酸鋁配置濃度為100 mg·kg-1鋁溶液，對照處理pH 4.5，無鋁的正常營養(yǎng)液。在第20 d天進行脅迫處理，每個處理設3次重復。栽植30 d后進行指標的測定。

1.3 測定指標及方法

株高：將植株拉直，用卷尺測量其最高點距地面的垂直距離。

脯氨酸含量：采用茚三酮顯色法[17]進行測定。

根系活力：采用TTC法[18]進行測定。

有機酸含量：采用高效液相色譜法進行測定，測定苜蓿根系中草酸[19]、蘋果酸[17]和檸檬酸[20]的分泌量。

為消除不同材料間本身固有的生物學特性差異，將各指標轉換成相對值來衡量不同材料的耐鋁性。計算公式為：指標相對值=處理測定值/對照測定值×100%。

聚類分析采用離差和平法。

綜合評價采用隸屬函數(shù)法進行計算：

X(u)=(X—Xmin)/(Xmax—Xmin)

(1)

X(u)=1—(X—Xmin)/(Xmax—Xmin)

(2)

式中：X(u)為隸屬函數(shù)值；X為鋁脅迫處理下某指標的相對值；Xmax為此指標中的最大值；Xmin為此指標的最小值。若某一指標與耐鋁性呈正相關，用公式(1)，若呈負相關，用公式(2)計算[21-22]。

1.4 數(shù)據分析

利用軟件SPSS 20進行數(shù)據分析，差異顯著性采用Duncan檢驗法。用DPS v8.01進行聚類分析，以及使用Excel 2010制作圖表和隸屬函數(shù)分析。

2 結果與分析

2.1 鋁脅迫對苜蓿株高、根系活力及脯氨酸相對含量的影響

由表2可以看出不同苜蓿材料在鋁脅迫下表現(xiàn)不同，同一材料不同指標表現(xiàn)差異明顯。從相對株高上來看，各材料均小于50%，說明在鋁脅迫下苜蓿生長收到明顯抑制。相對株高較高的材料依次為7，6，10，2，13號，較低的材料為12，29，26號，最大值為48.33%，最小值為17.50%，最低值為最高值的36.21%，差異顯著(P<0.05)。從相對根系活力上來看，較高的材料依次為10，12，14，28，5，15號，較低的依次為25，23，24，21，6，20，16號材料，最大值為95.75%，最小值為43.36%，最低值為最高值的45.28%，差異顯著(P<0.05)。從相對脯氨酸含量上來看，較高的材料依次為18，28，27，12號，較低的依次為21，11，9，6，16，23號材料，最大值為573.43%，最小值為126.82%，最低值為最高值的22.11%，差異較顯著(P<0.05)。綜合比較各材料相對株高、相對根系活力和相對脯氨酸含量發(fā)現(xiàn)，株高較高的材料，其根系活力和脯氨酸含量并不都呈現(xiàn)較高的水平，以12號材料為例，其株高較低，但根系活力和脯氨酸含量較高。不同材料各生理指標在鋁脅迫下表現(xiàn)差異不同。

表2 鋁脅迫下苜蓿的相對株高、相對根系活力以及相對脯氨酸含量變化Table2 The relative plant height,relative root activity and relative proline content of alfalfa under aluminum stress/%

續(xù)表2

注：表中同列不同小寫字母表示不同苜蓿材料在鋁脅迫下差異顯著(P<0.05)，下同

Note:The different lowercase letters in the same column represented significant differences within the different alfalfa materials under the same aluminum concentration at the 0.05 level,the same as below

由表3可以看出，鋁脅迫顯著增加了供試材料紫花苜蓿有機酸的分泌。從相對草酸含量上來看，所有材料相對脯氨酸含量均大于100%，相對草酸含量較高的材料為20，15，25，12，10號，較低的材料為18，23，22，6，21，26號，其中，最大值為563.48%，最小值為104.72%，最低值為最高值18.58%，差異顯著(P<0.05)。從蘋果酸含量上來看，較高的材料依次為10，26，25，2，5，22，7號，較低的材料依次為27，21，28，20，24，9，8，23，6號，且均小于100%，其中，最大值為343.41%，最小值為22.10%，差異顯著(P<0.05)。從檸檬酸含量上來看，較高的材料依次為25，2，5，12，13，29號，較低的材料依次為27，26，21，7，8，28，23號，且均小于100%，其中，最大值為398.70%，最小值為20.37%，差異顯著(P<0.05)。綜合上述分析來看，除了2號和5號材料在各指標下差異不顯著外(P>0.05)，其余材料在高濃度鋁脅迫下均有較大的差異(P<0.05)。

表3 鋁脅迫下苜蓿相對有機酸含量的變化Table3 The relative organic acids content of alfalfa under aluminum stress/%

綜合表2和表3可知，2號和5號材料在各指標下差異不顯著，其余材料在高濃度鋁脅迫下均有較大的差異。比較27個材料形態(tài)指標和生理指標的相對值發(fā)現(xiàn)，形態(tài)指標在評價耐鋁性材料中雖有重要的參考價值，但不能作為孤立的參考指標存在，而有機酸含量積累的多少在此次評價耐鋁性苜蓿材料中也占有十分重要的地位，應綜合多指標進行材料耐鋁性的評判。

2.2 耐鋁性綜合評價

2.2.1 苜蓿耐鋁性聚類分析 利用上述各生理指標指標對27份苜蓿資源進行聚類分析(圖1)。

采用離差和平法可將27個紫花苜蓿材料分為三大類(Ⅰ—Ⅲ)。I類分別為2，5，30，25，12，13，14，15號，為耐鋁性較強的材料，根系活力表現(xiàn)較高，脯氨酸和有機酸含量普遍表現(xiàn)較高。Ⅱ類分別為6，8，24，16，19，20，29號材料，為耐鋁性適中的材料，除個別材料外，根系活力表現(xiàn)一般，脯氨酸和有機酸含量普遍表現(xiàn)中等。Ⅲ類分別為7，10，21，26，11，22，23，27，9，28，18，17號材料，為耐鋁性較差的材料，根系活力表現(xiàn)一般，個別材料中脯氨酸含量出現(xiàn)較高的情況，而有機酸含量普遍表現(xiàn)中等，個別材料表現(xiàn)出較低的情況。

圖1 27個紫花苜蓿材料的耐鋁性聚類圖Fig.1 Results from the cluster analysis of escaped alfalfa based on their performances under aluminum stress

2.2.2 耐鋁性綜合評價 將供試苜蓿各指標隸屬函數(shù)值計算出并累加得各材料的綜合評價總分值，結果見表4，可以看出15號材料得分最高，29號材料得分最低。結合圖1聚類分析法與表2-4綜合評價得出，12，13，14，15號材料為耐鋁性較強的材料，在鋁脅迫下這四份材料植株高度和根系活力普遍表現(xiàn)較高，脯氨酸和有機酸含量積累較多。其耐鋁性強弱順序依次為：15>12>14>13號。

表4 隸屬函數(shù)綜合評價得分及排名Table 4 The total scores and ranks of subordinate function

3 討論

3.1 鋁脅迫處理對苜蓿生長具有明顯的抑制作用

鋁脅迫處理對苜蓿生長具有明顯的抑制作用。多項研究表明[23-26]，植物株高和根系活力可作為植物耐鋁毒鑒定的有效指標。在本試驗中，株高和根系活力一定程度上反映了各苜蓿材料在鋁脅迫下耐受性。本實驗結果表明，株高和根系活力隨著高濃度鋁處理受到明顯的抑制，這與Lei等[27]在鋁脅迫對植物株高、根系活力的研究結果一致，鋁毒降低了植物的生物量、根系活力，顯著抑制根系伸長。早前，Davis等[28]研究表明，株高決定產量的65%，王水良等[28]人的研究也表示根生長情況和活力水平直接影響地上部分的生長和營養(yǎng)狀況及產量水平。因而，相對株高和相對根系活力也直接反映了本試驗供試苜蓿材料在鋁脅迫下的生長性能。本試驗中，不同材料的生物學特性不同，為消除不同材料間本身固有的差異性，故選取相對值衡量不同材料的耐鋁性。而15，12，14號苜蓿材料其相對株高表現(xiàn)均不是最高，在綜合評價中卻排名前三，這也充分說明了植株高度在決定該材料耐受性程度上并不能作為唯一的指標，不同苜蓿材料在鋁脅迫下各指標表現(xiàn)差異不同，應結合其他指標做出綜合評判。

脯氨酸被認為是植物逆境脅迫的產物，在逆境脅迫下植物體內游離脯氨酸的增加是一個普遍現(xiàn)象，作為滲透調節(jié)物質，在逆境條件下的升高有利于植物對逆境脅迫的抵抗，從而在一定條件下增強植物對環(huán)境的適應性[30-31]。在本試驗中，供試材料葉片的相對脯氨酸含量在高鋁濃度脅迫下大量積累，這可能由于合成蛋白質受阻而導致游離脯氨酸的大量積累，與于波等[31]人研究結果一致。從本實驗結果來看，苜蓿的相對脯氨酸含量均有提高，且均大于100%，說明苜蓿在鋁毒害下，脯氨酸會大量積累，這與Patrícia等[33]研究報道中鋁會誘導脯氨酸含量的積累結論相似，也證實了脯氨酸含量積累的多少在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗性的苜蓿也可以通過積累游離脯氨酸來減輕鋁毒害，提高其耐受性。

3.2 供試苜?？赏ㄟ^根系分泌有機酸減輕鋁毒害

大量證據表明，有機酸的分泌在螯合鋁離子、減少根系對鋁的吸收、降低其生物毒性方面具有重要作用，被認為是植物耐鋁最重要的機制[14、34-35]。植物根系分泌的有機酸與其根際中的鋁離子絡合形成有機酸——鋁復合物，如鋁與檸檬酸、蘋果酸、草酸等有機酸絡合所形成的復合物，這些復合物對植物體的毒性較低，因此，在鋁脅迫下植物根系分泌有機酸可以減輕鋁的毒性、增強其對鋁的忍耐能力[36]。本研究結果表明在高濃度鋁處理條件下，供試材料草酸、蘋果酸、檸檬酸積累量普遍增加，證實了Samacda等[37]苜蓿在鋁毒害下有機酸顯著積累的研究結論。同時，宮家珺[38]研究認為，高濃度鋁脅迫時苜蓿生長速率迅速下降，各指標間的變化差異顯著(P<0.05)。本研究結果也證實，高濃度鋁脅迫下各指標變化幅度更大，大部分材料的相對有機酸含量大于100%。這可能由于高濃度鋁處理時，耐受性較差的材料表現(xiàn)受傷害程度更大，其耐受性降低，差異性也表現(xiàn)更加顯著(P<0.05)。

3.3 苜蓿耐鋁性鑒定應進行多指標綜合評價

植物的耐受性是由形態(tài)生理方面的綜合變化來體現(xiàn)，不同植物對某一具體生理指標的耐鋁性反應及耐鋁性強弱表現(xiàn)均不一定相同，孤立的某個指標不能評價該植物的耐鋁性。本試驗結果表明苜蓿耐鋁性可能受不同脅迫程度的影響，是其自身生理調節(jié)作用的綜合反映，且鋁脅迫對苜蓿的影響是多方面的，不能靠單一指標來評價。綜合各指標發(fā)現(xiàn)，大多材料在鋁脅迫下，植株表現(xiàn)較高的苜蓿材料，根系活力普遍表現(xiàn)較高，脯氨酸和其根系分泌有機酸含量也普遍表現(xiàn)較高。但以本研究中12號苜蓿材料為例，其株高表現(xiàn)較低，而根系活力表現(xiàn)一般，脯氨酸含量以及有機酸含量均表現(xiàn)較高，綜合評價卻排名第二。充分說明了苜蓿材料的耐受性不能單靠個別指標來評價，應參照更多的指標，因此，建立綜合的評價體系十分重要。本研究鑒于耐鋁性影響因素的復雜性，為了使試驗結果更為客觀、準確，綜合鋁處理下各項生理指標相對值變化規(guī)律的研究，以各指標的測定值進行耐鋁性聚類分析，同時以隸屬函數(shù)值綜合評價，兩種評價結果具有一定的相似性，結果也更為可觀。而隸屬函數(shù)綜合評價法較聚類分析法更為直觀、準確，可為今后的抗逆性材料篩選與評定提供一定的參考價值。本試驗綜合評價結果表明，15，12，14和13號耐鋁性較強，可作為在富酸鋁化土壤推廣種植的苜蓿材料。

4 結論

本研究表明，鋁脅迫處理對苜蓿株高、根系活力具有明顯的抑制作用，供試材料株高和根系活力在高濃度鋁脅迫下顯著抑制。酸鋁脅迫下，均有脯氨酸、根系分泌有機酸的積累現(xiàn)象，供試材料相對脯氨酸和三種相對有機酸含量均在高濃度鋁處理下有著顯著積累現(xiàn)象。

采用聚類分析及隸屬函數(shù)法對苜蓿耐鋁性進行綜合評價，結果表明高濃度鋁處理時15號材料表現(xiàn)最好，其次的是12，14和13號材料，這四份材料可以作為耐酸鋁性苜蓿選育的遺傳基礎材料。可結合其他性能表現(xiàn)在酸性富鋁化土壤地區(qū)推廣應用。