劉南清, 林紹艷, 沈益新

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 江蘇 南京 210095； 2. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400； 3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210095)

假儉草(Eremochloaophiuroides(Munro.) Hack.)起源于我國(guó)熱帶與亞熱帶地區(qū)，因其耐酸性土壤、耐粗放管理，以及養(yǎng)護(hù)成本低、成坪質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)，在世界各地廣泛應(yīng)用。然而，假儉草耐寒性差，在我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)冬季低溫條件下會(huì)出現(xiàn)枯黃休眠的現(xiàn)象，極大地影響了其景觀應(yīng)用價(jià)值，及在該區(qū)域的推廣應(yīng)用。因此，研究假儉草的耐寒機(jī)制，探索改善假儉草耐寒性的管理技術(shù)，已成為當(dāng)前草坪草研究中的一個(gè)重要課題。

諸多的研究表明，低溫脅迫發(fā)生時(shí)，植物細(xì)胞內(nèi)正常的氧代謝受到干擾，活性氧自由基產(chǎn)生率上升；從而產(chǎn)生過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷或瓦解[1]。此外，植物體內(nèi)的酶活性對(duì)低溫脅迫具有很強(qiáng)的敏感性。低溫脅迫下，酶活性的降低會(huì)導(dǎo)致植物光合效率的降低[2]。但與此同時(shí)，當(dāng)?shù)蜏孛{迫發(fā)生時(shí)，植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)同時(shí)出現(xiàn)抗氧化酶防御系統(tǒng)以及其他抗氧化物質(zhì)，這些抗氧化酶防御系統(tǒng)與抗氧化物質(zhì)能消除活性氧積累，防止膜脂過(guò)氧化，從而保護(hù)植物免受低溫傷害。植物抗氧化酶防御系統(tǒng)與抗氧化物質(zhì)主要包括抗氧化物酶與一些小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)?？寡趸钢饕ǔ趸锲缁?Super oxidase dismutase,SOD)、過(guò)氧化氨酶(Catalase,CAT)、過(guò)氧化物酶(Peroxidase,POD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(Asorbate peroxidase,APX)和谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase,GR)等[3-4]。而小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要包括有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與無(wú)機(jī)離子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其中有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要包括植物細(xì)胞內(nèi)的可溶性多糖(Soluble sugar,SS)、脯氨酸(Proline,Pro)以及一些游離態(tài)多胺(Polyamines,PAs)。大量的研究表明，植物的耐寒性與體內(nèi)的抗氧化酶活性以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量有直接的正相關(guān)關(guān)系，對(duì)有些植物進(jìn)行外源噴施適當(dāng)濃度的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可以提高低溫脅迫下植物體內(nèi)的抗氧化酶活性以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度，從而提高植物的耐寒性[5-8]。盡管?chē)?guó)內(nèi)外已經(jīng)對(duì)假儉草耐寒機(jī)理進(jìn)行了較多的研究，然而，通過(guò)施用外源多胺以提高假儉草耐寒性的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。在低溫脅迫下，施用外源多胺對(duì)假儉草體內(nèi)的細(xì)胞膜系統(tǒng)、抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等方面的影響尚不明確。

本研究以適當(dāng)濃度的外源腐胺(Putrescine,Put)與亞精胺(Spermidine,Spd)對(duì)假儉草進(jìn)行葉面噴施，旨在明確低溫脅迫條件下，施用外源多胺對(duì)假儉草葉片細(xì)胞的膜系統(tǒng)、抗氧化酶活性以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累的影響，以期探索出能提高假儉草耐寒性的有效化學(xué)調(diào)控途徑，為假儉草在長(zhǎng)江流域以北區(qū)域推廣和應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為2008年采集于廣東信宜的野生假儉草材料，該材料表現(xiàn)出明顯的低溫敏感特性。自2008年8月始，供試材料一直種植于試驗(yàn)地種質(zhì)資源圃，正常水肥管理，生長(zhǎng)良好。

2015年8月采集其健康的匍匐莖，并切成4～5 cm長(zhǎng)的莖段，每段帶4～5個(gè)莖節(jié)，每小段留葉2片，扦插于塑料培養(yǎng)盆中(直徑10 cm，高8 cm)，盆內(nèi)為等量的混合培養(yǎng)基質(zhì)(泥炭土∶珍珠巖=3∶1)，每盆扦插假儉草莖段12段。遮陽(yáng)網(wǎng)覆蓋，放置于玻璃大棚內(nèi)栽培，澆水保濕。當(dāng)假儉草莖段長(zhǎng)出新葉成活時(shí)，揭開(kāi)遮陽(yáng)網(wǎng)，每隔5天澆水1次，每周每盆施用1/2濃度霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液25 ml，每周修剪一次，修剪高度為8 cm，使假儉草生長(zhǎng)均勻一致。

1.2 試驗(yàn)方法

2015年9月02日，將盆栽的假儉草試驗(yàn)材料從大棚移植至人工氣候模擬箱中進(jìn)行適應(yīng)性栽培，人工氣候模擬箱的光照(1 000 lx，日照時(shí)間14 h)，晝夜溫度設(shè)置為30℃/20℃，相對(duì)濕度80±5%，不進(jìn)行低溫處理的對(duì)照組CK在試驗(yàn)過(guò)程中一直保持在該生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)。

兩周后分別使用濃度為0.1 mM的腐胺(Put)、亞精胺(Spd)溶液或去離子水對(duì)假儉草進(jìn)行葉面噴施處理，每周?chē)娛?次，連續(xù)噴施3周。每個(gè)噴施處理3個(gè)重復(fù)。每次噴施時(shí)，均勻噴施葉面，噴施至葉片由少量液滴滴落為止。

10月7日，進(jìn)行低溫處理，溫度為8℃，每天光照時(shí)間、光照強(qiáng)度和相對(duì)濕度不變。低溫處理35 d。低溫處理期間，每5天澆水1次，定期調(diào)換材料的位置。分別于低溫處理的第7，14，21，28，35 d，選取長(zhǎng)勢(shì)一致完全展開(kāi)的倒二葉(莖尖往下第二葉)進(jìn)行分析測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 相對(duì)電導(dǎo)率(Electrolyte leakage,EL)測(cè)定 采用相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定方法[9]。取樣后，將葉片用去離子水沖洗3次，并用潔凈濾紙吸干表面水分。葉片剪成0.5 cm的小片段，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g，裝入具塞試管。加25 ml去離子水，真空抽氣10 min，振蕩，加塞，在室溫下靜置l h。3次重復(fù)。用電導(dǎo)率儀測(cè)得電導(dǎo)率值E1。沸水浴10 min，冷卻后測(cè)得電導(dǎo)率值E2。3次重復(fù)。相對(duì)電導(dǎo)率(EL)=E1/E2×100%。

1.3.2 丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量測(cè)定 MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[10]。剪取葉片鮮樣0.5～1.0 g，在-80℃的液氮冷凍。解凍后，加7 mL磷酸鹽緩沖液(濃度為50 mM，pH 7.0)，冰浴中研磨。提取液放置于4℃與20 000 g下離心25 min。所得的上清液與三氯乙酸和硫代巴比妥酸充分反應(yīng)后，用分光光度計(jì)(Spectronic Instruments,New York)在532 nm與600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。使用Dhindsa的計(jì)算公式[11]計(jì)算出MDA的含量。

1.3.3 抗氧化物酶活性測(cè)定 SOD活性測(cè)定采用硝基藍(lán)四氮唑(NBT)光還原法進(jìn)行[12]。CAT、APX和POD活性的測(cè)定參考湯紹虎編寫(xiě)的植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程的方法[13]。酶活性的測(cè)定采用分光光度計(jì)進(jìn)行。CAT在240 nm下測(cè)定,APX在290 nm下測(cè)定,POD在470 nm下測(cè)定。

1.3.4 SS含量測(cè)定 SS含量采用蒽酮比色法測(cè)定[14]。剪取約1.0 g的假儉草鮮葉，加入液氮研磨成粉末，然后加入1 ml的提取液，再加入1 ml的苯酚，充分震蕩混合，最后加入5 ml的濃硫酸(95%)，把混合反應(yīng)液放入水浴鍋中，在30℃水溫下水浴30 min后，取出反應(yīng)液冷卻15 min。用分光光度計(jì)(Spectronic Instruments,New York,NY)在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)液的吸光值。用葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別計(jì)算出葡萄糖(G)、蔗糖(S)與果糖(F)的含量，進(jìn)而計(jì)算出可溶性多糖(SS)的含量。

1.3.5 Pro含量測(cè)定 Pro含量采用茚三酮法進(jìn)行測(cè)定[15]。剪取葉片鮮樣約300 mg，放入研缽中。加入液氮。將鮮樣研磨成粉末，然后加入5 ml磺基水楊酸進(jìn)行萃取。將萃取液移到試管中。先后加入2 ml乙酸和2 ml茚三酮進(jìn)行顯色反應(yīng)。將試管放置在水浴鍋中沸水浴45 min，取出冷卻。最后往冷卻的反應(yīng)液中加入4 ml的甲苯完成顯色反應(yīng)。將上層顯色液在分光光度計(jì)520 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。使用L-脯氨酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)作為比色所用的校準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.6 PAs含量測(cè)定 根據(jù)劉俊等[16]測(cè)定多胺的方法進(jìn)行Put，Spd和Spm含量的測(cè)定。取0.1 g左右研磨好的葉片干樣粉末，放入離心管中。加入2 ml冷卻后的高氯酸進(jìn)行多胺的提取。冰浴60 min，然后在15 000 g下離心30 min。將上清液轉(zhuǎn)入離心管中，冷凍保存在—20℃的低溫冰箱。在堿性介質(zhì)中對(duì)上清液中的多胺進(jìn)行苯甲?；磻?yīng)，然后使用二乙醚提取多胺衍生物。將醚相干燥后，用甲醇進(jìn)行溶解。

使用高效液相色譜儀(HPLC，美國(guó)Waltham公司)測(cè)定游離態(tài)多胺(PAs)的含量。色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)。柱溫30℃。流動(dòng)相為甲醇和水(體積比為70∶30)，流速0.7 mL·min-1。檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。進(jìn)樣量10 μL，間隔35 min。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Put，Spd和Spm標(biāo)樣曲線(xiàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SAS軟件(SAS 9.0版)對(duì)低溫脅迫期間各個(gè)不同外源物質(zhì)噴施處理下假儉草體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物含量以及抗氧化酶活性等進(jìn)行方差分析。用Fisher檢驗(yàn)法確定各不同處理間滲透調(diào)節(jié)物含量與抗氧化酶活性差異的顯著性，P值為0.05水平。

2 結(jié)果和分析

2.1 對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)透性與丙二醛含量的影響

試驗(yàn)過(guò)程中，未進(jìn)行低溫脅迫處理的對(duì)照組(CK)，其葉片內(nèi)EL的變化不明顯，一直保持在9.22%～10.91%的低水平。低溫脅迫處理組內(nèi)，在低溫脅迫進(jìn)行的第7天開(kāi)始，不同處理的假儉草其葉片內(nèi)的EL值快速持續(xù)升高，各不同處理間差異明顯。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，各處理的EL值大小依次為：C >C+Put>C+Spd(圖1)(其中：C代表低溫脅迫+純水噴施處理；C+Put代表低溫脅迫+0.1 mM Put噴施處理；C+Spd表示低溫脅迫+0.1 mM Spd噴施處理)。

圖1 低溫脅迫期間葉片相對(duì)電導(dǎo)率的變化Fig.1 Leaf electrolyte leakage changed during chilling stress注：CK=未進(jìn)行低溫脅迫處理的對(duì)照組；C =低溫脅迫+純水噴施處理；C+Put=低溫脅迫+0.1 mM Put噴施處理；C+ Spd =低溫脅迫+0.1 mM Spd噴施處理，下同Note:CK=No cold stress;C=Cold stress+H2O;C+Put= Cold stress +0.1 mM Put;C+Spd= Cold stress +0.1 mM Spd,the same as below

低溫脅迫過(guò)程中，MDA的變化與EL的變化趨勢(shì)基本一致。未進(jìn)行低溫脅迫處理的對(duì)照組在試驗(yàn)中一直保持較低的MDA含量，且沒(méi)有明顯變化。低溫處理組在低溫脅迫進(jìn)行的第7 d后，其葉片內(nèi)的MDA含量快速持續(xù)升高，MDA含量在不同的處理間存在明顯差異。低溫脅迫過(guò)程中，不同處理的假儉草葉片內(nèi)MDA含量由高至低依次為：C >C+Put>C+Spd(圖2)。

圖2 低溫脅迫期間葉片MDA含量的變化Fig.2 Leaf MDA content change during chilling stress

2.2 對(duì)抗氧化物酶活性的影響

由表1可知，在低溫脅迫期間，假儉草葉片內(nèi)的SOD、POD、APX與CAT的活性都出現(xiàn)了明顯的變化，且在不同的低溫脅迫時(shí)間下因不同的處理表現(xiàn)出明顯差異。

2.2.1 SOD活性 低溫脅迫下，SOD的活性先出現(xiàn)快速升高，在脅迫的第7 d(10月14日)達(dá)到最高，之后開(kāi)始持續(xù)下降，這反應(yīng)了SOD對(duì)環(huán)境變化的敏感性。分析結(jié)果同時(shí)表明，在低溫脅迫發(fā)生的10月14日-11月11日期間，噴施過(guò)Spd與Put的處理其葉片內(nèi)SOD活性顯著高于只噴施去離子水的處理(P<0.05)。具體表現(xiàn)為：處理C+Spd比C高出15.3%～33.0%；處理C+Put比C+H2O高出3.4%～27.9%。除了11月4日，在低溫脅迫的其他時(shí)期內(nèi)，處理C+Spd比處理C+Put都具有更高的SOD活性。

2.2.2 POD活性 低溫脅迫使得假儉草葉片內(nèi)的POD活性同樣表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。低溫脅迫過(guò)程中，C+Spd葉片內(nèi)的POD活性都高于C，差異顯著(P<0.05)；C+Put在低溫脅迫整個(gè)過(guò)程中其葉片內(nèi)的POD活性同樣都高于C+H2O，但是僅在低溫脅迫的第7-21 d(10月14-10月28日)表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)，在低溫脅迫的第28-35 d(11月4-11日)，則差異不顯著。

2.2.3 APX活性 對(duì)APX活性的分析表明，低溫脅迫發(fā)生后的第7 d(10月14日)，各處理假儉草葉片內(nèi)的APX活性升到最高，隨后持續(xù)下降。低溫脅迫過(guò)程中，處理C+Spd與C+Put葉片內(nèi)的APX活性都高于處理C，且在第7-28 d(10月14日-11月4日)表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)。此外，處理C+Spd葉片內(nèi)的APX活性一直高于處理C+Put，且在第14-28 d(10月21日-11月4日)表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)。

2.2.4 CAT活性 低溫脅迫下，各處理間假儉草葉片內(nèi)的CAT活性表現(xiàn)出“升-降-升-降”的波浪形趨勢(shì)，在低溫脅迫發(fā)生的第7 d(10月14日)達(dá)到最高后，開(kāi)始持續(xù)下降，在11月4日又略有回升，然后在11月11日急劇下降至最低。在所有低溫脅迫期間內(nèi)，不同處理間的CAT活性由高至低依次為：C+Spd>C+Put> C+H2O。其中在低溫脅迫的第7-28 d，各處理間差異顯著(P<0.05)。在低溫脅迫發(fā)生的第35 d(11月11日)，各處理葉片內(nèi)的CAT活性降至最低，處理C+Spd葉片內(nèi)的CAT活性仍然顯著高于C+H2O；C+Put葉片內(nèi)的CAT活性雖然高于C，但是差異不顯著。

2.3 對(duì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.3.1 SS含量 低溫脅迫發(fā)生后，假儉草葉片內(nèi)的SS含量先是急劇增加，在低溫脅迫的第7 d達(dá)到最高，隨后其含量持續(xù)降低，至低溫脅迫結(jié)束的第35 d降至最低(圖3)。整個(gè)低溫脅迫期間，各處理葉片內(nèi)的SS含量由高到低排序?yàn)椋篊+Spd> C+Put> C。不同處理之間存在顯著差異(圖3)。

圖3 外源多胺對(duì)低溫脅迫下假儉草葉片內(nèi)可溶性糖含量的影響Fig.3 Effects of exogenous polyamine on soluble sugar content in the leaves of centipede grass under chilling stress注：小寫(xiě)字母表示在相同處理時(shí)間內(nèi)4個(gè)處理間的顯著性差異(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate significant difference within the same treatment time among different treatment at the 0.05 level,the same as below

表1 外源多胺對(duì)低溫脅迫下假儉草葉片內(nèi)酶活性的影響Table 1 Effect of exogenous polyamines on antioxidase activities of centipede grass under chilling stress

注：小寫(xiě)字母表示同一行(同一處理的不同時(shí)間)在0.05水平上顯著，大寫(xiě)字母表示同一列(同一時(shí)間的不同處理)在0.01水平上顯著

Note:Different lowercase letters indicate significant difference within the same row (the same treatment among different treatment time) at the 0.05 level,and different capital letters indicate significant difference within the same column (the same treatment time among different treatments) at the 0.01 level

2.3.2 Pro含量 隨著低溫脅迫時(shí)間的持續(xù)，假儉草各處理葉片內(nèi)的Pro含量(圖4)呈先升后降的變化趨勢(shì)。低溫脅迫的第7 d，各處理葉片內(nèi)的Pro含量達(dá)到最高，之后開(kāi)始逐漸降低，至低溫脅迫的第35 d降至最低。

在低溫脅迫期間的7-35 d內(nèi)，C+Spd葉片內(nèi)的Pro含量高于C+Put與噴水對(duì)照C，差異明顯，其中在低溫脅迫的第7 d，分別高出10.7%與13.8%。在低溫脅迫的7-28 d，C+Put葉片內(nèi)的Pro含量明顯高于噴水對(duì)照C，在試驗(yàn)結(jié)束的第35 d，二者間葉片內(nèi)的Pro含量差異不明顯。

圖4 外源多胺對(duì)低溫脅迫下假儉草葉片內(nèi)脯氨酸含量的影響Fig.4 Effects of exogenous polyamine on proline content in the leaves of centipede grass under chilling stress

2.3.3 PAs含量 1) Put含量，低溫脅迫的前7 d，各處理的假儉草其葉片內(nèi)的Put含量快速升高，之后隨著低溫脅迫的持續(xù)，Put的含量開(kāi)始降低(圖5)。在低溫脅迫發(fā)生的第7-21 d內(nèi)，處理C+Spd與C+Put葉片內(nèi)的Put含量顯著高于C與對(duì)照組CK。

圖5 外源多胺對(duì)低溫脅迫下假儉草葉片腐胺含量的影響Fig.5 Effects of exogenous polyamine on Put content in the leaves of centipede grass under chilling stress

2) Spd含量，在低溫脅迫期間，假儉草葉片內(nèi)的Spd含量呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢(shì)，在低溫脅迫的第14 d達(dá)到最高，之后隨著低溫脅迫時(shí)間的持續(xù)，Spd含量下降。所有的處理的假儉草葉片內(nèi)的Spd含量都顯著高于對(duì)照CK，處理C+Put與C+Spd內(nèi)的Spd含量顯著高于處理C，而處理C+Spd內(nèi)的Spd含量又顯著高于處理C+Put(圖6)。

圖6 外源多胺對(duì)低溫脅迫下假儉草葉片亞精胺含量的影響Fig.6 Effects of exogenous polyamine on Spd content in the leaves of centipede grass under chilling stress

3) Spm含量，在低溫脅迫期間，假儉草葉片內(nèi)的Spm含量在低溫脅迫后的第7 d達(dá)到最高，之后開(kāi)始持續(xù)下降，呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。在低溫脅迫期間，各處理的Spm由高至低排序依次為：C+Spd> C+Put> C。不同處理之間差異顯著(圖7)。

圖7 外源多胺對(duì)低溫脅迫下假儉草葉片精胺含量的影響Fig.7 Effects of exogenous polyamine on Spm content in the leaves of centipede grass under chilling stress

3 討論

細(xì)胞膜脂的過(guò)氧化與植物的抗寒性有著密切的關(guān)系[17]。低溫脅迫下，植物細(xì)胞的膜系統(tǒng)是植物受低溫傷害的原初部位[18]。暖季型草坪草在低溫脅迫下細(xì)胞質(zhì)膜會(huì)受到損傷，細(xì)胞內(nèi)的EL與MDA含量升高。本研究中，假儉草在低溫脅迫下，其葉片細(xì)胞的EL與MDA含量持續(xù)上升。這意味著假儉草受到了低溫傷害，且隨著低溫脅迫時(shí)間的持續(xù)，低溫傷害加重。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫期間，與對(duì)照相比，前期進(jìn)行外源噴施Spd與Put的假儉草其葉片細(xì)胞內(nèi)的EL值與MDA含量都顯著低于噴水對(duì)照，其中噴施Spd的處理具有最低的EL值和MDA含量。噴施Put處理的EL值和MDA含量高于噴施Spd處理，但顯著低于噴水對(duì)照。這意味著低溫脅迫前施用外源Spd與Put可以顯著降低假儉草細(xì)胞的膜損傷，降低膜脂的過(guò)氧化程度，提高了假儉草的耐寒性，Spd的效果顯著優(yōu)于Put。

植物在低溫脅迫發(fā)生時(shí)，其體內(nèi)卡爾文循環(huán)的羧化過(guò)程會(huì)受到抑制，導(dǎo)致卡爾文循環(huán)關(guān)鍵光合酶的活性降低，從而降低了光能利用率與CO2同化，造成O2的光合電子通量增加，從而產(chǎn)生大量的活性氧[2]。這些活性氧對(duì)細(xì)胞的質(zhì)膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性產(chǎn)生較大損害。而植物體內(nèi)抗氧化酶可以通過(guò)清除活性氧以保護(hù)植物免受傷害。因此，保持植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的生產(chǎn)和清除之間的平衡是植物在脅迫條件下存活的必要條件?？寡趸甘侵参矬w細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分。以往的研究表明，在低溫脅迫下，抗氧化酶的活性與草坪草的耐寒性緊密相關(guān)[5-6]。以往對(duì)假儉草耐寒性的研究也曾發(fā)現(xiàn)，與不耐寒的品種相比，假儉草的耐寒突變體和其他作物的耐寒品種在低溫脅迫期間能保持較高的抗氧化酶活性，積累更多的抗氧化物，從而提高耐寒性[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在冷脅迫發(fā)生的第7 d開(kāi)始，外源Spd與Put處理顯著增加了假儉草葉片細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶(SOD，POD，APX和CAT)的活性。抗氧化酶活性的提高與EL和MDA含量降低基本一致。說(shuō)明Spd與Put處理提高假儉草耐寒性與改善其低溫脅迫下的抗氧化酶活性密切相關(guān)。此外，與降低細(xì)胞膜損傷程度一致；低溫脅迫下Spd處理提高抗氧化酶活性的效果好于Put。

在滲透脅迫發(fā)生時(shí)，植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)主動(dòng)積累一些小分子化合物如氨基酸、氨基化合物、可溶性多糖、有機(jī)酸，以及一些無(wú)機(jī)離子，以此降低細(xì)胞滲透勢(shì)和水勢(shì)，維持膨壓，降低傷害。此類(lèi)化合物統(tǒng)稱(chēng)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[22]。諸多研究表明，低溫脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累與其耐寒性有著密切關(guān)系。脯氨酸與可溶性多糖是草坪草細(xì)胞內(nèi)與抗寒性相關(guān)的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，當(dāng)?shù)蜏孛{迫發(fā)生時(shí)，溝葉結(jié)縷草(Zoysiamatrella)、結(jié)縷草、假儉草細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸含量顯著增加[23-25]，對(duì)早熟禾在低溫脅迫下的生理響應(yīng)的研究也發(fā)現(xiàn)，脯氨酸的含量與耐寒性呈顯著的正相關(guān)關(guān)系[26]。野牛草(Buchloedactyloides)、鹽草(Distichlisspicata)和結(jié)縷草(Zoysiajaponica)在低溫下脅迫下細(xì)胞積累較多的果糖可以提高抗寒性[27-29]。低溫脅迫下，葉片細(xì)胞內(nèi)積累較高濃度可溶性多糖的狗牙根品種具有更強(qiáng)的耐寒性[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)冷脅迫發(fā)生時(shí)，外源Spd與Put處理顯著提高了假儉草葉片細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸(Pro)與可溶性多糖(SS)的含量，與相對(duì)電導(dǎo)率(EL)值與丙二醛(MDA)含量的變化呈相反趨向。這說(shuō)明，在低溫脅迫下，Spd與Put處理提高其體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量與改善假儉草的耐寒性密切相關(guān)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，在提高假儉草細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸與可溶性多糖含量，以及降低EL值與MDA含量等的效果上，Spd顯著優(yōu)于Put。

低溫脅迫下，具有較高的Spd與Put合成能力的轉(zhuǎn)基因植物具有更強(qiáng)的耐寒性[31-33]。過(guò)表達(dá)CdSAMDC的轉(zhuǎn)基因假儉草具有較強(qiáng)的耐寒性，這可能與其細(xì)胞內(nèi)具有較高的Spd和Spm含量有關(guān)[34]。具有較高Spd、Put與Spm含量的假儉草耐寒突變體比假儉草的野生型表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐寒性[20]。相反，通過(guò)基因敲除技術(shù)或者下調(diào)ADC,SAMDC,SPDS和SPMS等基因的表達(dá)，降低了植物細(xì)胞內(nèi)的多胺含量，導(dǎo)致了植物耐寒、耐旱與耐鹽能力的下降[32,35-36]。在低溫脅迫發(fā)生時(shí)，小麥的耐寒性與其體內(nèi)的Put含量呈正相關(guān)[37]。當(dāng)寒脅迫發(fā)生時(shí)，耐寒品種的水稻秧苗根部與芽中的Put、Spm和Spd的含量都急劇增加[34]。外源多胺的施用已經(jīng)成功地應(yīng)用于提高植物的抗逆性[38-40]。施用外源多胺可以提高植物內(nèi)源多胺的含量，提高抗氧化酶的活性，降低丙二醛的含量，扭轉(zhuǎn)鹽脅迫造成的生長(zhǎng)抑制，提高植物耐鹽性[41-46]。干旱脅迫下，匍匐翦股穎內(nèi)源多胺的含量與耐旱性存在正相關(guān)關(guān)系[47]，施用外源亞精胺可以提高匍匐翦股穎在干旱脅迫下的內(nèi)源多胺含量，提高其耐旱性[48]。在冷脅迫下，施用外源多胺可以提高鷹嘴豆與芥菜型油菜的抗氧化酶活性，降低逆境脅迫導(dǎo)致的過(guò)氧化造成的損害，從而提高了耐寒性[49]。外源多胺噴施對(duì)提高假儉草的耐寒性有著明顯的作用[50]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源Spd與Put處理顯著提高了低溫脅迫下假儉草體內(nèi)的Put、Spd和Spm含量，提高了耐寒性。這與以往的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，外源噴施Spd比Put對(duì)提假儉草細(xì)胞內(nèi)的Spd、Spm的效果更加顯著，而外源Put則對(duì)提高假儉草葉片內(nèi)的Put含量的作用明顯。

4 結(jié)論

在低溫脅迫過(guò)程中，假儉草葉片內(nèi)的相對(duì)電導(dǎo)率與丙二醛含量快速上升，假儉草出現(xiàn)了低溫傷害現(xiàn)象。外源噴施Spd與Put可以顯著降低假儉草在低溫脅迫下葉片細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)電導(dǎo)率與丙二醛含量，同時(shí)顯著提高其抗氧化酶的活性，以及脯氨酸、可溶性多糖與游離態(tài)多胺等物質(zhì)的含量，進(jìn)而提高假儉草的低溫脅迫耐受性，降低低溫傷害。這表明，外源多胺物質(zhì)的合理使用是提高假儉草抗寒性，延長(zhǎng)其綠色期的一個(gè)直接、可行、有效途徑，在假儉草養(yǎng)護(hù)中具有較為廣闊的應(yīng)用前景。