姜紅巖， 檀鵬輝， 滕 珂， 尹淑霞*， 武菊英*

(1. 北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院， 北京 100083； 2. 北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心， 北京 100097)

轉(zhuǎn)錄因子能夠與基因啟動子的順式作用元件結(jié)合來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而調(diào)控生命活動中的各種信號傳導(dǎo)途徑[1]。NAC(NAM(No apical meristem)，ATAF(Arabidopsis transcription activation factor)1/2，CUC2(Cup-shaped cytoledon))是植物中所特有的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、脅迫響應(yīng)、次生生長調(diào)控及激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮著重要作用[2-4]。近年來，越來越多的研究不僅僅局限于轉(zhuǎn)錄因子本身，對轉(zhuǎn)錄因子上下游的調(diào)控機(jī)制的研究也越來越多。

酵母雙雜交是鑒定兩個蛋白相互結(jié)合的最直接和最廣泛的分子生物技術(shù)[5]。酵母雙雜交系統(tǒng)基于酵母中的一個Gal4轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子上有兩個不同的結(jié)構(gòu)域，一個是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation Domain，AD)，一個是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding Domain，BD)[1,6]，這兩個結(jié)構(gòu)域是互相獨(dú)立的，只有當(dāng)這兩個結(jié)構(gòu)域在空間上足夠接近時，才會激活Gal4的轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)控下游報告基因的表達(dá)[1,6-8]。若將已知的編碼AD分別與待篩選的cDNA文庫中不同插入片段相連接，獲得‘獵物’載體；BD連接目的基因，獲得‘誘餌’載體，共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞[9-10]。當(dāng)酵母細(xì)胞中表達(dá)的誘餌蛋白與獵物載體表達(dá)的某個蛋白質(zhì)發(fā)生互作，AD與BD就會靠近，報告基因就會表達(dá)[10]。通過這一系統(tǒng)，可為在cDNA文庫中篩選與目的蛋白結(jié)合的上下游蛋白提供可能。目前cDNA文庫的構(gòu)建主要通過SMART、Cap-trapper等技術(shù)，通過將某一物種的基因組中的所有基因斷裂并轉(zhuǎn)入單獨(dú)的質(zhì)粒中，為目的蛋白篩選互作蛋白提供基礎(chǔ)。

日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)是一種抗逆性強(qiáng)的暖季型草坪草，廣泛應(yīng)用于各種運(yùn)動場草坪、園林綠化、家庭庭院等草坪中[13-15]。草坪草的生存環(huán)境復(fù)雜多變，經(jīng)常遭受干旱、高鹽、低溫和病蟲害等逆境脅迫[16-17]。這些逆境脅迫會影響植物的生長發(fā)育，甚至造成草坪草死亡，嚴(yán)重影響景觀[16-17]。近年來越來越多的研究表明NAC轉(zhuǎn)錄因子對逆境脅迫的響應(yīng)過程中的調(diào)節(jié)具有重要作用[2,18]。鹽芥(Thellungiellasalsuginea)中的TsNAC1過表達(dá)可以提高非生物脅迫抗性，尤其是鹽脅迫抗性；TsNAC1能夠結(jié)合并且正調(diào)節(jié)與離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因TsVP1、MYBH、HB12，能夠抑制LSH1、TXT2，并且能夠直接調(diào)控MSI4基因的表達(dá)[4]。前期的研究表明ZjNAC2能夠響應(yīng)非生物脅迫。干旱處理后ZjNAC2的表達(dá)下調(diào)，而鹽處理后ZjNAC2的表達(dá)上調(diào)，但目前對ZjNAC2轉(zhuǎn)錄因子在日本結(jié)縷草中脅迫抗性的作用機(jī)理及上下游的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并不清楚。本研究旨在通過前期構(gòu)建的高質(zhì)量的日本結(jié)縷草的均一化cDNA文庫，利用酵母雙雜技術(shù)篩選與ZjNAC2轉(zhuǎn)錄因子互作的蛋白，以期為進(jìn)一步了解日本結(jié)縷草抗脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)中所用的日本結(jié)縷草品種為‘Meyer’，由江蘇省中科院植物研究所劉建秀研究員會惠贈。RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自O(shè)MEGA公司(美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、pMD19-T載體、SYBR Mix購自TaKaRa公司(大連，中國)；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司(北京，中國)。X-α-Gal(TaKaPa)、YPDA酵母培養(yǎng)基及缺陷型培養(yǎng)基購自泛基諾公司(北京，中國)。pGBKT7酵母載體、Y2HGold酵母菌株均為本實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所)所保存。

1.2方法

1.2.1 誘餌載體pGBKT7-ZjNAC2及cDNA文庫的構(gòu)建 以健康生長的日本結(jié)縷草為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以ZjNAC2-F/ZjNAC2-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測正確后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，陽性克隆菌液送睿博興科生物技術(shù)有限公司(北京)測序，獲得ZjNAC2正確的基因序列。以pMD19-ZjNAC2的質(zhì)粒為模板，以BD-ZjNAC2-F/BD-ZjNAC2-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測正確后與pGBKT7酵母載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，陽性菌液送睿博興科生物技術(shù)有限公司(北京)測序，測序正確的菌液保存并提取質(zhì)粒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以不同程度黃化的日本結(jié)縷草葉片為材料，通過TaKaRa生物公司(大連)構(gòu)建高質(zhì)量的日本結(jié)縷草的均一化cDNA文庫。

1.2.2 ZjNAC2轉(zhuǎn)錄自激活驗(yàn)證 通過LiAc[19]的方法制備Y2HGold酵母感受態(tài)，將上述構(gòu)建好的誘餌載體pGBKT7-ZjNAC2及對照質(zhì)粒pGBKT7轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)中，涂布在SD/-Trp培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)。待長出菌落后，挑取單克隆菌落于YPDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，之后將酵母菌液分別按比例1：10、1：100進(jìn)行稀釋并點(diǎn)于SD/-Trp、SD/-Trp-His-Ade固體培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)2～3天，觀察其生長情況。

1.2.3 酵母雙雜交文庫的篩選 將誘餌載體pGBKT7-ZjNAC2+pGADT7-cDNA文庫及陽性對照pGBKT7-53+pGADT7-T、陰性對照pGBKT7-lam+pGADT7-T分別共轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于SD/-Trp-Leu固體培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)2～3天。陽性對照pGBKT7-53+pGADT7-T和陰性對照pGBKT7-lam+pGADT7-T分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Leu-Trp固體培養(yǎng)基上。挑取單克隆菌落在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal或SD/-Leu-Trp-His-Ade固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)2～3天。挑取陽性克隆的菌落于YPDA中培養(yǎng)，以AD-R/T7-F為引物對陽性菌落進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)程序?yàn)?5℃10 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃60 s，40個循環(huán)；72℃5 min，12℃保溫。經(jīng)凝膠電泳鑒定后有條帶的PCR產(chǎn)物送睿博興科生物技術(shù)有限公司(北京)測序，確定候選基因。

表1 引物列表Table 1 Primers list

1.2.4 候選基因的生物信息學(xué)分析 通過百邁客的云平臺小工具(https://console.biocloud.net)進(jìn)行NR、GO、KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)等注釋，獲得候選基因的生物信息學(xué)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘餌載體pGBKT7-ZjNAC2的構(gòu)建

以與pMD19-T載體連接的ZjNAC2質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后得到1條約1100bp左右的條帶(圖1)。通過菌落PCR，將條帶大小正確的菌液送睿博興科生物技術(shù)有限公司(北京)測序，測序結(jié)果經(jīng)過序列比對后正確，表明pGBKT7-ZjNAC2載體成功構(gòu)建。

圖1 pGBKT7-ZjNAC2載體構(gòu)建Fig.1 Construction of the pGBKT7-ZjNAC2 vector

2.2 ZjNAC2轉(zhuǎn)錄自激活驗(yàn)證

分別將pGBKT7、pGBKT7-ZjNAC2載體轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)中，涂布在SD/-Trp培養(yǎng)基上。30℃下培養(yǎng)3天后，pGBKT7、pGBKT7-ZjNAC2在SD/-Trp培養(yǎng)基上均能正常生長(圖2)，表明pGBKT7、pGBKT7-ZjNAC 2對酵母菌株Y2HGold無毒性作用。挑取在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長的菌落，分別稀釋10、100倍點(diǎn)于SD/-Trp、SD/-Trp-His-Ade固體培養(yǎng)基上。2～3天后，SD/-Trp培養(yǎng)基上菌落正常生長；而SD/-Trp-His-Ade上無菌落生長(圖3)。試驗(yàn)結(jié)果表明，ZjNAC2沒有轉(zhuǎn)錄自激活活性，可以進(jìn)行酵母雙雜交的篩選。

2.3 酵母雙雜篩選候選基因

以pGBKT7-53+pGADT7-T為陽性對照，pGBKT7-lam+pGADT7-T為陰性對照與pGBKT7-ZjNAC2+pGADT7-cDNA分別轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在SD/-Trp-Leu缺陷型固體培養(yǎng)基上。結(jié)果表明，對照組與試驗(yàn)組均能在SD/-Trp-Leu缺陷型培養(yǎng)基上生長(圖4)，表明質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化成功。將陽性對照和陰性對照分別涂布在SD/-Leu-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上，陽性對照的菌落能夠正常生長，而陰性對照不能在SD/-Leu-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上生長。挑取在SD/-Trp-Leu缺陷型培養(yǎng)基上生長的菌落在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal缺陷型培養(yǎng)基上劃線。結(jié)果表明，大部分菌落均能在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal缺陷型培養(yǎng)基上生長并且變藍(lán)(圖4)。挑取30個變藍(lán)的菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，凝膠電泳結(jié)果顯示有25個菌落可以擴(kuò)增出條帶(圖5)。試驗(yàn)選取了20個有條帶的PCR產(chǎn)物送到睿博興科生物技術(shù)有限公司(北京)測序。

圖2 酵母毒性檢測Fig.2 Yeast toxicity test

圖3 ZjNAC2轉(zhuǎn)錄自激活驗(yàn)證Fig.3 Transcriptional self-activation validation ofZjNAC2注：SD：合成的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基Note:SD:synthetic dropout nutrient medium

圖4 ZjNAC2酵母雙雜篩庫Fig.4 Yeast two-hybrid library screening

圖5 候選克隆PCR檢測Fig.5 Candidate clone PCR detection

2.4 候選基因的生物信息學(xué)分析

通過百邁客云平臺的基因功能注釋功能，對測序得到的20個基因序列進(jìn)行了NR注釋、GO注釋、KEGG注釋。NR注釋分析結(jié)果顯示，20個注釋基因NR同源物種比對到9個物種，其中比對到高粱(Sorghumbicolor)中的注釋基因最多，6個；其次是玉米(Zeamays)5個，粟(Setariaitalica)4個(表2)。GO注釋結(jié)果顯示ZjNAC2的這20個候選互作蛋白參與的生物進(jìn)程有9種，包括代謝過程、生物調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)過程等(圖6)。KEGG注釋結(jié)果顯示候選蛋白富集到了半乳糖代謝、自噬調(diào)節(jié)、糖酵解、戊糖磷酸途徑、嘧啶代謝等代謝通路中。

表2 ZjNAC2互作蛋白及同源物種Table 2 ZjNAC2 interaction proteins and homologous species

3 討論

NAC基因在植物發(fā)育和脅迫的不同方面發(fā)揮重要作用，包括胚胎發(fā)育、次生壁形成、葉片衰老、側(cè)根發(fā)育、病毒真菌感染、機(jī)械損傷及脅迫響應(yīng)等[3]。云杉[20](Piceawilsonii)中的PwNAC2轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)了植物對非生物脅迫的耐受性，通過酵母雙雜篩選到PwNAC2與RFCP1發(fā)生互作，熒光素酶互補(bǔ)和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)均證實(shí)了兩者的相互作用，并且PwRFCP1參與了開花調(diào)控。通過酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，大豆中的GmWRKY27與GmMYB174發(fā)生互作，GmMYB174直接抑制GmNAC29基因表達(dá)，并且減少活性氧產(chǎn)生和脯氨酸降解，使大豆的抗性增強(qiáng)[21]。本研究通過該技術(shù)對日本結(jié)縷草中的ZjNAC2轉(zhuǎn)錄因子篩選互作蛋白，結(jié)果顯示該試驗(yàn)獲得了50個左右的陽性菌落，為進(jìn)一步深入研究ZjNAC2的功能提供了基礎(chǔ)。

試驗(yàn)挑選了30個陽性菌落進(jìn)行PCR檢測，檢測結(jié)果顯示有25個菌落擴(kuò)增出了條帶，表明存在假陽性菌落。并且有多個菌落擴(kuò)增出了多個條帶，產(chǎn)生多個條帶的結(jié)果很可能是共轉(zhuǎn)化時轉(zhuǎn)入了多個質(zhì)粒。通過對20個送測序的互作蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，NR注釋分析顯示20個注釋基因中比對到高粱(Sorghumbicolor)中的注釋基因最多。在ZjNAC2篩選的互作蛋白中，篩選到一個與抗病相關(guān)的蛋白EDR1-Like。研究表明，擬南芥(Arabidopsisthaliana)中的EDR1、EDR2、EDR3基因是調(diào)控植物抗病的關(guān)鍵基因，基因的突變會導(dǎo)致植物對白粉病菌抗性提高[22-23]。小麥(Triticumaestivum)中的TaEDR1基因類似于擬南芥中的EDR1基因，其表達(dá)受白粉病菌的誘導(dǎo)而增強(qiáng)[24-25]。同時還篩選到了SDF2、NFY-A3、40S核糖體、SIP1等蛋白，其中NF-Y是一類普遍存在于高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎和種子發(fā)育、脅迫響應(yīng)、脫落酸信號傳導(dǎo)、葉綠素合成、氮固定、植物生長發(fā)育等進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[26-27]；40S核糖體是構(gòu)成核糖體的重要組成部分，對核糖體轉(zhuǎn)錄效率和穩(wěn)定性具有重要影響[28]；SIP1基因最早從煙草中被鑒定出，與細(xì)胞的生長和增殖及葉片的生長發(fā)育有關(guān)[29]。通過酵母雙雜試驗(yàn)篩選到了與ZjNAC2互作的蛋白，通過對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究提供了重要參考。

圖6 ZjNAC2候選互作蛋白的Gene ontology注釋Fig.6 Gene ontology annotation of the ZjNAC2 candidate interaction protein

酵母雙雜篩庫技術(shù)是確定兩個蛋白互作的關(guān)鍵技術(shù)之一，具有高靈敏性和完善的報告系統(tǒng)[30-31]。但酵母雙雜篩選只能捕獲直接配對的相互作用，包括弱相互作用[1]。蛋白質(zhì)的表面可能存在一些低親和力區(qū)域，其他蛋白會在這些區(qū)域與目的蛋白作用形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的復(fù)合物，這些情況都可能引起報告基因的表達(dá)，因此存在假陽性的情況[5,32]。所以在后續(xù)研究中還要通過免疫共沉淀或雙分子熒光互補(bǔ)等試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證這些蛋白與ZjNAC2互作的真實(shí)性，并對篩選到的蛋白逐一驗(yàn)證并通過相互作用的蛋白研究ZjNAC2的調(diào)控機(jī)制及生物學(xué)通路。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了誘餌載體pGBKT7-ZjNAC2，轉(zhuǎn)錄自激活活性檢測表明ZjNAC2沒有轉(zhuǎn)錄自激活活性，可以進(jìn)行酵母雙雜交文庫的篩選。酵母雙雜篩庫的試驗(yàn)中隨機(jī)挑取了30個陽性菌落，篩選到20個與ZjNAC2互作的蛋白并對其進(jìn)行了NR注釋、GO注釋及KEGG注釋。初步篩選到4個與抗病、植物生長發(fā)育過程相關(guān)的候選互作蛋白，為進(jìn)一步探究ZjNAC2在日本結(jié)縷草中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。