王偉偉， 王勇鋒， 張舒夢(mèng)， 王竹林， 孫風(fēng)麗， 張 超， 奚亞軍

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors,TFs)在植物響應(yīng)逆境脅迫中具有重要的作用，它能夠激活或者抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄，使植物適應(yīng)或抵御外界環(huán)境的變化[1]。近年來(lái)，AP2/ERE、NAC、MYB、WRKY和bZIP等轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境響應(yīng)中被廣泛研究。其中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分布最廣泛、最保守的轉(zhuǎn)錄因子之一，在人、動(dòng)物、植物、微生物和昆蟲(chóng)中均有發(fā)現(xiàn)[2]。bZIP的家族命名來(lái)源于成員蛋白序列共有的保守bZIP結(jié)構(gòu)域，其結(jié)構(gòu)域大約有60～80個(gè)氨基酸殘基，由一個(gè)堿性氨基酸區(qū)和一個(gè)亮氨酸拉鏈組成[3]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子不僅參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，還參與調(diào)控植物抵抗高鹽、干旱和寒冷等惡劣的自然環(huán)境[4]，比如bZIP家族中的ABI5蛋白是ABA抑制種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中的重要信號(hào)組分，受ABA、干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，能提高植物對(duì)外源ABA的敏感性，在干旱條件下參與靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[5]。S亞家族在擬南芥中是最大的bZIP亞家族，其中AtbZIP11/ATB2在高碳水化合物組織和維管束中被光上調(diào)表達(dá)，并且參與蔗糖轉(zhuǎn)錄后抑制調(diào)控[6]；AtbZIP1,AtbZIP2,AtbZIP44和AtbZIP53可能參與平衡碳水化合物的需求和供應(yīng)[7]。同時(shí)，單子葉植物和雙子葉植物的數(shù)據(jù)表明bZIP轉(zhuǎn)錄因子S亞家族同源蛋白在脅迫處理后被轉(zhuǎn)錄激活[8]。在水稻中發(fā)現(xiàn)，S亞家族成員OsbZIP16參與ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出顯著的抗旱性[9]；OsbZIP71在ABA介導(dǎo)的干旱和鹽耐受性中發(fā)揮重要作用[10]。

柳枝稷(PanicumvirgatumL.)屬于禾本科(Gramineae)黍?qū)?Panicum)，是一種多年生C4高大草本植物，具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、生物量潛力大、對(duì)環(huán)境友好等多種優(yōu)點(diǎn)[11-12]。作為不與糧爭(zhēng)地的模式能源植物，柳枝稷通常被種植在邊際土地[13]，因此往往遭受著干旱、洪澇、鹽漬、貧瘠等多種非生物逆境脅迫，顯著影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。目前，關(guān)于柳枝稷基因功能鑒定方面的研究較少，尋找響應(yīng)抗逆性相關(guān)的基因?qū)α︷⒌纳L(zhǎng)發(fā)育具有重要意義[14-16]。本研究通過(guò)對(duì)水稻OsbZIP16基因進(jìn)行同源克隆獲得柳枝稷PvbZIP8基因，隨后對(duì)PvbZIP8基因進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析、非生物脅迫下的表達(dá)模式分析以及組織特異性表達(dá)分析，以期為柳枝稷的抗逆生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

柳枝稷材料為四倍體低地型‘Alamo’品種，由西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥柳枝稷遺傳改良研究團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料培養(yǎng)與處理 將柳枝稷種子置于培養(yǎng)皿中發(fā)芽，7 d后轉(zhuǎn)移柳枝稷幼苗到水培培養(yǎng)液中，置于16 h光照/28℃和8 h黑暗/20℃的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。生長(zhǎng)36 d后取長(zhǎng)勢(shì)一致的柳枝稷用于不同的非生物脅迫處理。

試驗(yàn)進(jìn)行的脅迫處理包括鹽、干旱、高溫和低溫脅迫，分別將柳枝稷置于20%的PEG6000，250 mM的NaCl,16 h光照38℃/8 h黑暗30℃和低溫4℃下，之后在不同的時(shí)間點(diǎn)(0，2，6和12 h)取樣，以0 h處理的樣品為對(duì)照，每個(gè)處理選取10株柳枝稷的葉片組織，混合后用錫紙包裹，迅速放入液氮中冷凍，之后用自封袋包裹放入—80℃超低溫冰箱中保存。

用于組織特異性表達(dá)分析的柳枝稷材料取自于西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)地(108°4′26″ E，34°17′49″ N)，取材日期是2018年5-10月，選取的組織或器官分別為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的根、莖、葉、節(jié)和葉鞘以及生殖生長(zhǎng)時(shí)期的小穗和種子[17]，材料保存在-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2.2 柳枝稷總RNA的提取和cDNA的合成 利用TRIZOL法提取植物組織的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara,Dalian,China)進(jìn)行cDNA的合成。

1.2.3PvbZIP8基因的克隆 通過(guò)JGI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)獲取柳枝稷PvbZIP8基因的序列[18]，利用Primer 6軟件設(shè)計(jì)上游引物(5′- AACCACTGCTTGTTTCCTTCTAC-3′)和下游引物(5′- CGATTGTGCCGATTCATATTAGTTG-3′)，以柳枝稷cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：稀釋后的cDNA 3 μl，2 × Phanta Max Buffer 25 μl，10 mM的dNTP Mix 1 μl，10 μM的上下游引物各1 μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μl，ddH2O 18 μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸40 s，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，最后72℃徹底延伸5 min，4℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，用DNA純化回收試劑盒回收目的片段，回收產(chǎn)物平末端加A后連接到PMD18-T克隆載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用通用引物M13進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.4 序列生物信息學(xué)分析 利用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找目的基因的開(kāi)放閱讀框，ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)分析相應(yīng)蛋白的理化性質(zhì)[19]，SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[20]，TMHMM2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域[21]，利用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)該蛋白是否含有信號(hào)肽位點(diǎn)[22]，ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)對(duì)該蛋白的進(jìn)行疏水性分析[19]，Psort Prediction (https://www.psort.org/)預(yù)測(cè)該蛋白的亞細(xì)胞定位[23]，NCBI-CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域[24]，利用NCBI-Blastp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索目的蛋白的同源序列，之后在Clustalx2.1軟件中進(jìn)行多序列比對(duì)并利用MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(Neighbor-joining tree,bootstrap設(shè)定初始值為1000次)[25,26]，最后運(yùn)用MEME (http://meme-suite.org/tools/meme) 在線程序?qū)vbZIP8基因進(jìn)行保守MOTIF分析[27]。

1.2.5 基因表達(dá)模式分析 分別以柳枝稷的根、莖、葉、節(jié)、葉鞘、小穗、種子和鹽、干旱、高溫、低溫脅迫處理后的葉片cDNA為模板，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)目的基因測(cè)序序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，上游引物和下游引物分別是F(5′-CTGGGACAGCAGACAAGCAAGAG-3′)和R(5′- CCACTTCCATCTCATTGAGCCTT-3′)。選擇Elongation Factor 1-α作為內(nèi)參基因[28]，其引物序列分別是PvEF-1-alphaF(5′-CCAAGAGGCCTTCAGACAAG -3′)和PvEF-1-alphaR(5′- TGAGATCCTTCACAGCAACG-3′)。之后通過(guò)QuantStudio 5定量PCR儀(Thermo Fisher，MA，USA)使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Takara,Dalian,China)試劑進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(Takara,Dalian,China)，反應(yīng)程序按以下步驟進(jìn)行：95℃下10 min；95℃下5 s，60℃下31 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[29]，分別檢測(cè)目的基因在柳枝稷不同組織或器官及不同脅迫處理下的表達(dá)情況，并通過(guò)IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，隨后利用Microsoft Excel繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PvbZIP8基因克隆和保守結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)柳枝稷基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得PvbZIP8的cDNA基因序列，隨后設(shè)計(jì)此基因的特異性擴(kuò)增引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得650 bp的特異性目的條帶(圖1)，測(cè)序分析后確認(rèn)該序列為柳枝稷PvbZIP8基因，其含有468 bp開(kāi)放閱讀框，編碼155個(gè)氨基酸(圖2)。通過(guò)NCBI-CDD網(wǎng)站分析此基因具有完整的bZIP結(jié)構(gòu)域(圖3)，屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員。通過(guò)NCBI-blastp比對(duì)發(fā)現(xiàn)此基因與哈氏黍bZIP8蛋白序列相似度達(dá)91%，故將其命名為PvbZIP8。

圖1 柳枝稷PvbZIP8基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification products of switchgrass PvbZIP8注：M．DL2000;1. PvbZIP8擴(kuò)增片段Note:M．DL2000;1. products of PvbZIP8

2.2 PvbZIP8蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam在線程序?qū)vbZIP8的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，分析結(jié)果表明，PvbZIP8基因翻譯的蛋白質(zhì)分子量為17.81 kDa，分子式是C761H1248N24O23S8，等電點(diǎn)是9.15。蛋白中含量較高的包括12.3%的亮氨酸、11.6%的精氨酸、8.4%的絲氨酸和8.4%的丙氨酸；Asp + Glu為21，Arg + Lys為25，屬于堿性蛋白質(zhì)，不穩(wěn)定系數(shù)是61.96，屬于不穩(wěn)定蛋白，總平均親水性GRAVY值是-0.669，為親水性蛋白。

此外，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示該蛋白主要包括α螺旋(Alpha helix,67.10%)、無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil,25.81%)、延伸鏈(Extended strand,4.52%)和β轉(zhuǎn)角(Beta turn,2.58%)(圖4)。對(duì)柳枝稷PvbZIP8蛋白跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，PvbZIP8不包含跨膜蛋白和信號(hào)肽位點(diǎn)；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示PvbZIP8蛋白主要定位于細(xì)胞核內(nèi)；利用ProtScale對(duì)柳枝稷PvbZIP8蛋白進(jìn)行疏水性分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白堿性氨基酸區(qū)具有親水性，亮氨酸拉鏈區(qū)具有疏水性。

圖2 PvbZIP8基因ORF序列及氨基酸序列Fig.2 ORF sequence and amino acid sequence of PvbZIP8

圖3 PvbZIP8蛋白的功能結(jié)構(gòu)域Fig.3 The conserved domain of the PvbZIP8 protein

圖4 PvbZIP8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Predicted secondary structure for PvbZIP8 protein

2.3 PvbZIP8同源比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用NCBI-blastp程序分析柳枝稷PvbZIP8基因與其它近源物種的蛋白同源性。結(jié)果表明，PvbZIP8蛋白的氨基酸序列與哈氏黍(Panicumhallii,XP_025825344.1)、谷子(Setariaitalica,XP_014660928.1)、玉米(Zeamays,XP_008645357.1)、糜子(Panicummiliaceum,RLM79681.1)和高粱(Sorghumbicolor,XP_002453452.1) 的相似性分別為91%、89%、68%、67%和65%。根據(jù)多序列比對(duì)分析(圖5)，柳枝稷PvbZIP8蛋白與其它物種有相似的結(jié)構(gòu)特征，都含有保守的bZIP(堿性亮氨酸拉鏈)結(jié)構(gòu)域，由一個(gè)堿性氨基酸區(qū)和一個(gè)亮氨酸拉鏈組成。利用MEGA5.05對(duì)同源性較高的物種構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖6)，發(fā)現(xiàn)柳枝稷PvbZIP8與哈氏黍親緣關(guān)系最近，其次是谷子和糜子；隨后通過(guò)MEME程序?qū)@些物種中的同源序列進(jìn)行模體分析，結(jié)果表明這些蛋白都含有保守的Motif 1和Motif 6，均位于bZIP保守結(jié)構(gòu)域(圖6)。

圖5 PvbZIP8蛋白與其它物種同源序列的多重比對(duì)Fig.5 Multiple alignment of PvbZIP8 protein with homologous sequences of other species

圖6 PvbZIP8與其它物種同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.6 Phylogenetic tree and protein conserved domain of PvbZIP8 homologous sequences among species注(note)：哈氏黍，Panicum hallii (XP_025825344.1)；谷子，Setaria italica (XP_014660928.1)；糜子，Panicum miliaceum (RLM79681.1)；高粱，Sorghum bicolor (XP_002453452.1)；玉米，Zea mays (XP_008645357.1)；水稻，Oryza sativa (EAY84825.1)；青蒿，Artemisia annua (PWA89386.1)；菜豆，Phaseolus vulgaris (XP_007157937.1)；三葉草，Trifolium subterraneum (GAU21676.1)

2.4 PvbZIP8基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式分析

在鹽、干旱、高溫和低溫脅迫下，柳枝稷PvbZIP8基因表達(dá)量發(fā)生明顯變化(圖7)。其中在鹽、高溫和低溫脅迫處理6 h，PvbZIP8的表達(dá)量上升到最大值，分別是對(duì)照組的37，58和8倍，隨后表達(dá)量在12 h開(kāi)始下降；在干旱脅迫處理2 h后，PvbZIP8被迅速誘導(dǎo)達(dá)到最大值，達(dá)到對(duì)照組的8倍。

圖7 PvbZIP8在多種非生物脅迫下的表達(dá)量分析Fig.7 Analysis of the expression level of PvbZIP8 under various abiotic stresses

2.5 PvbZIP8基因在不同組織或器官下的表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR技術(shù)，對(duì)柳枝稷根、莖、葉、節(jié)、葉鞘、小穗和種子的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明PvbZIP8基因在多個(gè)組織或器官中均有表達(dá)，其中在根、莖和葉中表達(dá)量較高，在節(jié)、葉鞘、小穗和種子中表達(dá)量較低，在葉片中表達(dá)量最高，約是表達(dá)量最低的節(jié)中的4倍(圖8)。

圖8 PvbZIP8在不同組織或器官的表達(dá)量分析Fig.8 Analysis of the expression of PvbZIP8 in different tissues or organs

3 結(jié)論與討論

bZIP轉(zhuǎn)錄因子是最大、保守性最高的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，bZIP蛋白由堿性氨基酸區(qū)和亮氨酸拉鏈區(qū)組成，堿性氨基酸區(qū)包含與特異的DNA序列發(fā)生作用的核定位信號(hào)和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，亮氨酸拉鏈區(qū)是由多個(gè)重復(fù)七肽組成。bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族已經(jīng)在擬南芥[30]、水稻[31]、玉米[32]、高粱[33]和大豆[34]等多個(gè)物種中進(jìn)行了詳細(xì)的鑒定和分析，前期研究中表明，bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族參與植物生長(zhǎng)、種子成熟和非生物脅迫等多種生物學(xué)進(jìn)程[30]?；赽ZIP家轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆過(guò)程中的重要性，本研究通過(guò)克隆得到柳枝稷PvbZIP8基因，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析和基因表達(dá)分析。研究結(jié)果表明，柳枝稷PvbZIP8基因編碼155個(gè)氨基酸，屬于堿性親水性蛋白質(zhì)，不包含跨膜蛋白和信號(hào)肽位點(diǎn)。該基因預(yù)測(cè)定位在細(xì)胞核內(nèi)，這與水稻中同源基因OsbZIP16結(jié)果相同[9]，可能具有反式激活活性。柳枝稷PvbZIP8基因與近源單子葉植物哈氏黍、谷子和糜子的同源序列相似度分別達(dá)到了91%，89%和91%，表明該基因在進(jìn)化過(guò)程中具有較高的保守型，并且具有典型的堿性氨基酸區(qū)N-X7-R/K和亮氨酸拉鏈區(qū)，屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，柳枝稷PvbZIP8與哈氏黍親緣關(guān)系最近，其次是谷子和糜子；在線程序MEME結(jié)果顯示哈氏黍、谷子和糜子具有相同的保守結(jié)構(gòu)域，二者之間相互印證，進(jìn)一步說(shuō)明PvbZIP8在進(jìn)化過(guò)程中的保守型，以此推測(cè)該基因在植物中發(fā)揮重要的功能。在水稻中bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族被分成10個(gè)亞家族，不同的亞家族具有不同的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，A亞家族中的基因大多數(shù)響應(yīng)ABA信號(hào)途徑[31]。通過(guò)與水稻bZIP家族基因進(jìn)行同源比對(duì)，柳枝稷PvbZIP8基因被定位在S亞家族，S亞家族被認(rèn)為與干旱、冷和傷害等非生物脅迫相關(guān)。例如水稻OsbZIP16在可以正向調(diào)控水稻的抗旱性，在干旱情況下OsbZIP16的表達(dá)量被顯著誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)OsbZIP16的轉(zhuǎn)基因水稻植株表現(xiàn)出顯著的抗旱性[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qPCR發(fā)現(xiàn)，柳枝稷PvbZIP8響應(yīng)鹽、干旱、高溫和低溫等多種非生物脅迫，在不同處理時(shí)間PvbZIP8基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯上調(diào)，表明該基因在柳枝稷中響應(yīng)多種非生物脅迫，對(duì)柳枝稷的抗逆耐受性具有重要意義，并且該基因在抗旱性中的表現(xiàn)與水稻OsbZIP16基因相一致。在組織特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，柳枝稷PvbZIP8基因在根、莖和葉中表達(dá)水平明顯高于其在種子、小穗、葉鞘和節(jié)中的表達(dá)，并且在葉片中表達(dá)水平最高，暗示該基因在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段發(fā)揮相對(duì)重要的作用，具有明顯的時(shí)空特異性表達(dá)特點(diǎn)。

目前，關(guān)于柳枝稷基因功能鑒定在bZIP家族中尚未報(bào)道，本研究通過(guò)對(duì)PvbZIP8轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，初步確定該基因在非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，將為進(jìn)一步研究柳枝稷PvbZIP8基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，并為柳枝稷中其它基因的研究提供重要參考意義。