閔 力 李恒存 郭慶東 王星宇 張澍田

(首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院消化分中心 國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心 消化疾病癌前病變北京市重點實驗室 北京消化中心，北京 100050)

在全世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌發(fā)病率排名第三，病死率排名第四，其中70%都是結(jié)腸癌[1]。近年來，我國的結(jié)腸癌發(fā)病率顯著上升，可能與人民生活方式及飲食習慣的改變有關(guān)[2]。結(jié)腸癌的發(fā)病原因復雜，在分子水平上進行機制研究，尤其是探索新的分子標志物與治療靶點，對于促進結(jié)腸癌診療，提高患者的預后具有重要意義[3-4]。

甘油-3-磷酸脫氫酶1(Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase 1，GPD1)基因位于染色體12q13.12上，是胞質(zhì)蛋白GPD1的編碼基因。GPD1催化磷酸二羥丙酮(dishychoxyactone phosphate, DHAP)與甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate,G3P)/NAD+之間的可逆氧化還原反應，且GPD1與線粒體亞型GPD2一起發(fā)揮將還原當量從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到線粒體的作用[5]。GPD1被認為是連接碳水化合物和脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因素，其活性異?？纱龠M肥胖患者中三?；视?triacylglycerol,TAG)合成的增加或減少[6]，在高三酰甘油血癥、脂肪肝、肝纖維化、肝腫大和脂肪性肝炎中起著至關(guān)重要的作用[7]。Basel-Vanagaite等[8]報道了攜帶GPD1純合子剪接突變(c.361-1G>C)的10名患者，表現(xiàn)為早發(fā)性肝腫大，肝臟脂肪變性和高三酰甘油血癥，是第一個確定GPD1基因與人類疾病相關(guān)的研究。然而，GPD1與腫瘤發(fā)展的關(guān)系研究較少。Zhou等[9]首先報道，GPD1在乳腺癌中表達下調(diào)，與乳腺癌患者預后相關(guān)，且GPD1在乳腺癌中發(fā)揮抑制腫瘤增生/遷移和侵襲的作用。在結(jié)腸癌中，GPD1的表達情況與功能目前尚無相關(guān)研究。

在本研究中，筆者主要探索了GPD1在結(jié)腸癌細胞系HCT-8中的作用，同時明確了GPD1表達與結(jié)直腸癌患者預后的關(guān)系，并結(jié)合生物信息學分析揭示了GPD1在結(jié)腸癌中低表達可能與其編碼基因高甲基化相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胎牛血清(fetal calf serum， FBS)、Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM)培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、胰蛋白酶(Trypsin)(Gibco公司，美國)、MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-ly)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]細胞增生試劑盒(Amresco公司，美國)；Lipofectamin 3000(Invitrogen公司，美國)；GPD1抗體(sc-376219, Santa Cruz公司, 美國)；恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱(三洋公司，日本)；25 cm2Costar無菌細胞培養(yǎng)瓶、6孔細胞培養(yǎng)板(Corning公司，美國)；多功能酶標儀(MD公司，美國)；超純水機(Millipore公司，美國)；GPD1 siRNA(吉瑪公司，中國)

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HCT-8人結(jié)腸癌細胞購自美國標準培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，在添加有10%(體積分數(shù))FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37 ℃和5%(體積分數(shù))CO2。應用Lipofectamine 3000試劑進行si-GPD1的轉(zhuǎn)染，以Western blotting驗證轉(zhuǎn)染效率。GPD1 siRNA購自蘇州吉瑪有限公司。si-GPD1-1的序列為5′-CACUGGCAUAUCUCUUAUU-3′，si-GPD1-2序列為5′-GCAGCAUGAGAAUGUCAAA-3′。NC siRNA序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。GPD1的qPCR檢測引物為5′-CCAGGGACAACTCCTGAAAGA-3′(正向)與5′-TTGGCGAAGGCTATCATCTCC-3′(反向)。GAPDH的qPCR檢測引物為5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′(正向)與5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′(反向)。

1.3 MTS實驗

將HCT-8細胞進行轉(zhuǎn)染后，在96孔板的每個孔中接種1 000個細胞，共接種4板細胞。在0、24、48和72 h的時間點分別取出1板細胞并將MTS試劑加入孔中。在37 ℃下孵育2 h后，用酶標儀檢測細胞活力。

1.4 集落形成實驗

將轉(zhuǎn)染處理后的HCT-8細胞消化后重懸并計數(shù)后，以1 000每孔的細胞濃度在6孔板中進行細胞接種，分為對照組(Normal control, NC)與GPD1干擾組，每組各設(shè)置3個復孔。細胞充分混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，培養(yǎng)至肉眼可見細胞集落時，進行細胞結(jié)晶紫染色并計數(shù)統(tǒng)計。

1.5 劃痕實驗

細胞轉(zhuǎn)染后以5×105的細胞濃度均勻接種在6孔板中，培養(yǎng)至細胞匯合。使用無菌移液管尖端在每個孔中進行劃痕處理。用無菌PBS進行洗滌以清除細胞碎片，然后在不含F(xiàn)BS的純培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在36 h的時間點，在每孔的相同位置拍攝記錄遷移狀態(tài)。

1.6 Transwell實驗

細胞轉(zhuǎn)染后用無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，以2×105的細胞濃度均勻接種在24孔板中，遷移實驗用Chamber為普通Chamber，侵襲實驗用Chamber為特制的Matrigel Invasion Chamber，在下室加入800 μL 含10%(體積分數(shù))胎牛血清的培養(yǎng)基，上室加入150 μL細胞懸液(無血清)，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24 h，用鑷子小心取出Chamber，吸干上室液體，移到預先加入約800 μL甲醇的孔中，室溫固定30 min后DAPI染色，觀察計數(shù)。

1.7 生物信息分析

筆者從TCGA官方網(wǎng)站上下載了結(jié)直腸癌患者Level 3的mRNA表達數(shù)據(jù)，以及甲基化芯片數(shù)據(jù)，根據(jù)GPD1的表達中位數(shù)將患者分為GPD1高表達與低表達兩組，從而比較這兩組的生存差異及對應的GPD1甲基化水平差異，同時對全部病例GPD1的mRNA表達水平及其甲基化水平進行了相關(guān)性分析。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 Western blotting驗證si-GPD1的基因敲低效率

多種結(jié)腸癌細胞系及正常結(jié)腸上皮細胞系中GPD1的表達結(jié)果顯示，不同細胞系之間GPD1表達水平差異有統(tǒng)計學意義，其中HCT-8細胞系中GPD1表達水平最高(圖1A)。為驗證si-GPD1的基因敲低效率，筆者以NC組及si-GPD1-1/si-GPD1-2轉(zhuǎn)染48 h后的HCT-8細胞提取總蛋白進行Western blotting實驗。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染處理后，與對照組相比，si-GPD1處理組GPD1蛋白表達量均明顯下降，證明si-GPD1效果可靠，為后續(xù)功能學實驗提供了保障(圖1B)。

圖1 GPD1在結(jié)腸癌細胞系HCT-8中的功能Fig.1 Functions of GPD1 in colon cancer cell HCT-8

A:GPD1 expression level in different colon cancer and noncancerous cell lines (reference cell: CCC-HIE-2，n=3);B: After si-GPD1-1/si-GPD1-2 treatment, GPD1 expression level in HCT-8 significantly decreased;CandD: After siRNA knock down ofGPD1, growth rate of HCT-8 was upregulated (n=3);E: After siRNA knock down ofGPD1, colony formation ability of HCT-8 was upregulated (n=3).**P<0.01,***P<0.001;GPD1:glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1;NC:Normal control.

2.2 GPD1干擾后結(jié)腸癌細胞增生、集落形成能力增強

MTS實驗與集落形成實驗，結(jié)果顯示，在GPD1基因敲低后，HCT-8細胞增生活力增強，3次重復實驗統(tǒng)計結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學意義(全部時間點重復測量數(shù)據(jù)方差分析P<0.001，72 h時間點t檢驗P<0.01)(圖1C，D)；在集落形成實驗中，與對照組相比，GPD1基因干擾組集落形成數(shù)量增多，且集落直徑較大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖1E)。

2.3 GPD1干擾后HCT-8細胞遷移運動能力無明顯變化

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，在干擾GPD1基因表達后，HCT-8細胞的遷移能力差異無統(tǒng)計學意義(圖2A)；Transwell遷移實驗及侵襲實驗驗證結(jié)果也顯示，GPD1敲低后HCT-8的遷移及侵襲能力均沒有顯著性變化(圖2B、C)。

圖2 GPD1對結(jié)腸癌細胞系HCT-8運動能力的影響Fig.2 Influence of GPD1 on motility of HCT-8 cells

A:After siRNA knock down ofGPD1, scratch healing ability of HCT-8 was unchanged (n=3);B: After siRNA knock down ofGPD1, transwell migration ability of HCT-8 was unchanged (n=3);C: After siRNA knock down ofGPD1, transwell invasion ability of HCT-8 was unchanged (n=3).GPD1:glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1;NC:Normal control.

2.4 GPD1低表達是結(jié)直腸癌預后不良的獨立風險因素

應用TCGA數(shù)據(jù)庫進行生物信息學分析，結(jié)果顯示，GPD1低表達的結(jié)直腸癌患者總存活率(χ2=4.1,P=0.040)及無病存活率(χ2=13.2,P<0.000 1)均明顯低于GPD1高表達患者(圖3A，B)。進一步納入患者年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期等臨床因素，進行多因素COX模型分析結(jié)果顯示，腫瘤的T分期、M分期，以及GPD1表達水平都是結(jié)直腸癌預后的獨立風險因素(Wald testχ2=44.0,P<0.001，表1)。

表1 GPD1表達水平是結(jié)直腸癌預后的獨立風險因素Tab.1 GPD1 expression level is an independent predictor of prognosis of CRC patients

GPD1:glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1;DFS: disease free survival;HR: hazard ratio;CI: confidence interval；CRC：colorectal cancer.

2.5 結(jié)直腸癌中GPD1的低表達可能與其編碼基因的高甲基化相關(guān)

為探究結(jié)直腸癌組織中GPD1低表達是否與DNA甲基化相關(guān)，筆者以TCGA數(shù)據(jù)庫進行了系統(tǒng)分析，結(jié)果顯示，GPD1甲基化水平高的腫瘤中GPD1的表達水平顯著較低(圖3C)，Pearson相關(guān)性分析顯示，GPD1的表達水平與其甲基化水平呈負相關(guān)(r=-0.253，P<0.001)(圖3D)。

圖3 GPD1表達水平與結(jié)直腸癌患者預后相關(guān)，結(jié)直腸癌中GPD1低表達與編碼基因高甲基化相關(guān)Fig.3 GPD1 expression level is associated with prognosis of CRC patients, which is also negatively correlated with GPD1 gene methylation level

A: Patients with a lowerGPD1 showed a shorter overall survival;B: Patients with a lowerGPD1 showed a shorter disease free survival;C: DifferentGPD1 expression level in differentGPD1 methylation status;D: mRNA level ofGPD1 was negatively correlated withGPD1 gene methylation level;CRC:colorectal cancer；GPD1:glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1.

3 討論

GPD1在機體代謝反應中發(fā)揮重要作用，前期研究[10]報道GPD1催化葡萄糖來源的DHAP與甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate，G3P)之間的轉(zhuǎn)化，后者參與生成三酰甘油，而GPD1基因突變被報道與多種代謝性疾病相關(guān)[7]。Zhou等[9]報道GPD1在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用，且與乳腺癌患者預后相關(guān)。然而，GPD1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的功能研究仍為空白。

在本研究中，筆者應用HCT-8結(jié)腸癌細胞系敲低GPD1基因表達進行功能實驗，結(jié)果表明，干擾GPD1后，結(jié)腸癌細胞HCT-8的增生活力與集落形成能力顯著提高，與GPD1在乳腺癌中的作用相一致[9]，而細胞遷移能力無顯著變化。此外，在本研究中筆者首先明確了GPD1表達水平與結(jié)直腸癌患者臨床預后的關(guān)系。通過對TCGA數(shù)據(jù)庫的生物信息學分析，筆者發(fā)現(xiàn)GPD1低表達結(jié)直腸癌患者的總存活率及無病存活率更低，且GPD1低表達是結(jié)直腸癌患者不良預后的獨立預測因素，這與筆者細胞功能學研究的結(jié)果是相一致的，均證明GPD1在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用。有研究[11]顯示DNA甲基化在不可逆啟動子沉默/調(diào)控基因表達中發(fā)揮重要作用。在GPD1的表達調(diào)控方面，筆者首次探索了GPD1在結(jié)直腸癌中低表達與其編碼基因甲基化之間的關(guān)系，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，GPD1低表達可能是由其編碼基因高甲基化引起的。

有文獻[12]報道GPD1在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用，且其抑癌作用與細胞增生有關(guān)，與本研究結(jié)果相一致。惡性腫瘤因其不受控制的細胞增生需要大量的能量支持[13]。而癌細胞表現(xiàn)出相對于正常分化細胞不同的細胞代謝方式[14]，過去十年的進展表明，腫瘤代謝改變的幾個特征是由各種致癌基因或腫瘤抑制因子的變化誘導的[15-17]。GPD1編碼蛋白甘油-3-磷酸脫氫酶1參與碳水化合物與脂質(zhì)之間的代謝轉(zhuǎn)化，Basel-Vanagaite等[8]報道了攜帶GPD1純合子剪接突變導致高三酰甘油血癥，而高三酰甘油血癥是結(jié)直腸癌的高危因素[18]。因此，筆者認為，GPD1蛋白缺失很可能通過干擾碳水化合物與脂質(zhì)之間的正常代謝而促進結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。但其具體作用機制還需要進一步深入研究來明確。

綜上所述，GPD1在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑制細胞增生與集落形成的作用，且GPD1低表達是結(jié)直腸癌患者不良預后的獨立預測因素。對GPD1的研究對發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌潛在治療靶點和預后評估指標具有重大的臨床意義，但其具體作用機制仍需要進一步探索。