馬登磊 張 旭 羅 藝 黃 蕊 李雅莉 李 林 張 蘭*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100053；2.神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053；3.北京市神經(jīng)藥物工程研究中心，北京 100053；4.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

微管相關(guān)蛋白tau(microtubule-associated protein tau，MAPT)是一種微管結(jié)合蛋白，在細(xì)胞中發(fā)揮正常的生理功能。在神經(jīng)元中tau蛋白主要富集于神經(jīng)元軸突內(nèi)，與微管結(jié)合并調(diào)節(jié)微管的組裝與解聚，維持微管的穩(wěn)定性[1]。而當(dāng)tau蛋白發(fā)生異常病變時(shí)，如發(fā)生基因突變、過度磷酸化等，會(huì)引起tau蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，無法發(fā)揮正常生理功能，并自身發(fā)生異常聚集而引起病理改變，最終導(dǎo)致一類tau蛋白相關(guān)疾病(tauopathy)的發(fā)生[2]。Tau蛋白病通常以tau蛋白異常磷酸化或異常聚集為特征，包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、連鎖于17號(hào)染色體tau突變伴帕金森綜合征的額顳葉癡呆(frontotemporal dementia with Parkinsonism linked totaumutations on chromosome 17，F(xiàn)TDP-17)、皮質(zhì)基底節(jié)變性等[3]。

在tau蛋白相關(guān)研究[4]中，tau轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型可以模擬AD及其他tau蛋白病的一些疾病特征，被廣泛應(yīng)用于相關(guān)疾病的病理機(jī)制研究及藥物研發(fā)中。在FTDP-17患者家系中發(fā)現(xiàn)了tau基因突變，P301位點(diǎn)導(dǎo)致的突變會(huì)引起患者出現(xiàn)癡呆為主的臨床表現(xiàn)[5]。因此，以P301L和P301S突變tau蛋白轉(zhuǎn)基因模型可以模擬AD及其他tau蛋白病(tauopathy)的一些疾病特征，例如tau蛋白的磷酸化和病理性沉積、神經(jīng)元死亡、認(rèn)知功能障礙等[6-7]。而目前在國內(nèi)，tau蛋白相關(guān)的疾病模型尚較少，因此本研究擬通過建立細(xì)胞和動(dòng)物的轉(zhuǎn)P301S/L模型，并觀察其tau蛋白病理改變，進(jìn)而為基于tau蛋白模型的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 模型的構(gòu)建

1.1.1 P301S/L質(zhì)粒的構(gòu)建

由南通大學(xué)劉飛教授惠贈(zèng)的tau40質(zhì)粒進(jìn)行點(diǎn)突變。其中tau40質(zhì)粒：PCI-neo，酶切位點(diǎn)：sal1+not1，表達(dá)最長(zhǎng)人源tau基因(tau441，2N4R; NCBI序列號(hào): NM_005910.5)，和一個(gè)HA的標(biāo)簽。突變的位點(diǎn)是位于exon10上面的301號(hào)脯氨酸(對(duì)應(yīng)的堿基序列是901～903：CCG)：其中P301S將CCG突變成TCG；P301L將CCG突變成CTG。

點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)：Mut-P301S-up：5′-ATAATATCAAACACGTCTCGGGAGGCGG-3′，Mut-P301S-down：5′-AGACGTGTTTGATATTATCCTTTGAGCCACA-3′，Mut-P301L-up：5′-TAATATCAAACACGTCCTGGGAGGCGGC-3′，Mut-P301L-down：5′-AGGACGTGTTTGATA TTATCCTTTGAGCCAC-3′。

1.1.2 P301L轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育

rTg4510[即Tg(Camk2a-tTA)1Mmay+Tg(tetO-MAPT*P301L)#Kha/J小鼠]轉(zhuǎn)基因小鼠由Tg(tetO-MAPT*P301L)#Kha/J轉(zhuǎn)基因小鼠和Tg(Camk2a-tTA)1Mmay轉(zhuǎn)基因工具小鼠配種，得到的陽性F1代[8]。其中Tg(tetO-MAPT*P301L)#Kha/J由北京理工大學(xué)慶宏教授惠贈(zèng)(購自The Jackson Laboratory，批號(hào):015815)。B6;CBA-Tg(Camk2a-tTA)1Mmay/JNju小鼠購自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇) 2015-0001。轉(zhuǎn)基因小鼠由Tg(tetO- MAPT*P301L)#Kha/J轉(zhuǎn)基因小鼠和Tg(Camk2a-tTA)1Mmay轉(zhuǎn)基因工具小鼠配種，F(xiàn)1代中兩個(gè)基因型均為陽性的小鼠為表達(dá)P301L-tau蛋白的rTg4510轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。

1.1.3 P301S轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育

由B6;C3-Tg(Prnp-MAPTP301S)PS19VleJnju轉(zhuǎn)基因小鼠與C57BL/6J野生型小鼠交配，得到F1代，進(jìn)行基因鑒定為陽性的即為PS19-P301S轉(zhuǎn)基因突變小鼠[9]。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)

動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中。采用12 h/12 h晝夜間斷照明，飼養(yǎng)溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，自由進(jìn)食飲水。繁育期間定時(shí)觀察小鼠情況，記錄仔鼠的出生日期、只數(shù)等，并于出生后14 d左右剪腳趾編號(hào)，21 d進(jìn)行離乳和雌雄分籠。新生仔鼠的編號(hào)剪下的腳趾用于基因型鑒定。使用KAPA快速基因分型試劑盒進(jìn)行基因分型(KAPA Biosystems公司，美國)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

人胚胎腎細(xì)胞HEK293T于5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d更換1 次含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基。細(xì)胞生長(zhǎng)至足夠豐度時(shí)，將105個(gè)/mL細(xì)胞接種于12 孔培養(yǎng)板中；24 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，用Polyplus轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒DNA∶轉(zhuǎn)染試劑=1 μg∶2 μL，放人培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)； 24 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)超聲，裂解細(xì)胞提取蛋白。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

本研究的細(xì)胞模型部分，分別在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同的質(zhì)粒，過表達(dá)相關(guān)的基因，分為空載體組(vector)、野生型tau蛋白(tau40)、P301L突變tau蛋白(P301L)和P301S突變tau蛋白(P301S)細(xì)胞模型組。在動(dòng)物模型部分，本研究應(yīng)用了P301L轉(zhuǎn)基因小鼠組(rTg4510)及同籠對(duì)照小鼠(nTg-1)，P301S轉(zhuǎn)基因小鼠組(PS19)及同籠對(duì)照小鼠組(nTg-2)，7月齡時(shí)分別取各組小鼠(n=3)做免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，11月齡時(shí)取各組小鼠(n=4)進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.5 動(dòng)物組織的取材

1.5.1 新鮮組織裂解

待轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)到11月齡時(shí)，分別取轉(zhuǎn)基因陽性鼠rTg4510和PS19小鼠及相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因陰性小鼠的大腦皮質(zhì)，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解勻漿，超聲裂解后室溫靜置30 min，4 ℃離心機(jī)以12 000 r /min 的轉(zhuǎn)速離心15 min 后取上清，測(cè)定各組中蛋白的濃度。加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃變性5 min，得到蛋白樣本用于Western blotting法檢測(cè)。

1.5.2 固定組織取材及冰凍切片

分別取7月齡的轉(zhuǎn)基因陽性鼠rTg4510和PS19小鼠及相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因陰性小鼠，麻醉后分別灌注0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液及4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定液。固定后取出腦組織，脫水后在冰凍切片機(jī)(620E，購自美國Thermo公司)中行冠狀位冰凍切片，切片厚度分別為30 μm。

1.6 Western blotting 法檢測(cè)蛋白表達(dá)

將等量蛋白上樣樣本按順序緩慢勻速加入丙烯酰胺凝膠的孔中，恒壓100 V 電泳、恒壓90 V電轉(zhuǎn)120 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉封閉(室溫，2 h)，一抗tau5抗體(識(shí)別總tau蛋白，1∶1 000，購自德國Calbiochem公司)，pS199/202抗體(識(shí)別Ser199/202位點(diǎn)磷酸化的tau，1∶1 000，購自美國Invitrogen公司)，PHF-1抗體(識(shí)別Ser399/404位點(diǎn)磷酸化的tau，1∶1 000，購自美國Abcam公司)，pS396抗體(識(shí)別Ser396位點(diǎn)磷酸化的tau，1∶1 000，購自美國Invitrogen公司)，pS404抗體(識(shí)別Ser404位點(diǎn)磷酸化的tau，1∶1 000，購自美國Invitrogen公司)，內(nèi)參抗體GAPDH(1∶1 000，購自美國CST公司)；一抗4 ℃孵育過夜后，二抗室溫孵育2 h，隨后TBST洗膜3次。在化學(xué)凝膠成像系統(tǒng)(Flour ChemHD2)中，加入化學(xué)發(fā)光液(購自德國Millipore公司)，得到合適的曝光條帶，進(jìn)一步進(jìn)行蛋白半定量分析。

1.7 免疫組織化學(xué)及免疫熒光法

冰凍切片提前切片于載玻片上，10%(體積分?jǐn)?shù))血清封閉。室溫封閉2 h后，孵育一抗β-(Ⅲ)-tubulin(1∶200，美國CST公司)AT8(識(shí)別Ser202/205位點(diǎn)磷酸化的tau，1∶1 000，美國Thermo公司)，一抗用抗體稀釋液稀釋，4 ℃過夜。PBST洗去一抗后，免疫組織化學(xué)法孵育免疫組織化學(xué)二抗及三抗。PBST漂洗后用DAB顯色液進(jìn)行顯色(中杉金橋公司)。脫水，中性樹膠封片，并在顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察。免疫熒光法則孵育熒光二抗，用含DAPI的封片劑封片，并在熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)tau40、P301L和P301S細(xì)胞模型中tau蛋白表達(dá)

在HEK293細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入等量的空質(zhì)粒(vector)，以及分別含有tau40、P301L和P301S突變tau的質(zhì)粒。Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示(表1)，轉(zhuǎn)染tau40、P301L和P301S的HEK293細(xì)胞均過表達(dá)了總tau蛋白，與空質(zhì)粒組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)了主要的tau蛋白磷酸化位點(diǎn)(與總tau相比較得到相對(duì)tau蛋白的磷酸化水平)，絲氨酸199/202以及396/404位點(diǎn)的磷酸化水平在轉(zhuǎn)染tau40、P301L和P301S，均顯著高于空質(zhì)粒組(P<0.05)，其中P301S的在這些位點(diǎn)的磷酸化水平要高于tau40和P301L組,詳見表1、圖1。

2.2 過表達(dá)tau40、P301L和P301S對(duì)HEK293細(xì)胞骨架形態(tài)的影響

本研究應(yīng)用β-tubulin識(shí)別細(xì)胞微管。與空質(zhì)粒組相比，過表達(dá)tau蛋白的細(xì)胞微管形態(tài)均發(fā)生了改變，未均勻分布在細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)生了收縮或聚集，且在P301L和P301S組中尤其明顯(圖2)。

2.3 P301L和P301S轉(zhuǎn)基因小鼠中tau蛋白及磷酸化tau蛋白的表達(dá)

取11月齡轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，與轉(zhuǎn)基因陰性小鼠相比，轉(zhuǎn)基因陽性小鼠tau蛋白表達(dá)均顯著增加(P<0.01)，而且rTg4510小鼠的tau蛋白表達(dá)量也顯著高于PS19小鼠(P<0.05，圖3)。進(jìn)一步檢測(cè)tau蛋白磷酸化水平(與總tau相比較)，轉(zhuǎn)基因陽性鼠在絲氨酸199/202、396、404位點(diǎn)的磷酸化水平均顯著高于轉(zhuǎn)基因陰性小鼠(P<0.05)，其中絲氨酸199/202、396磷酸化水平rTg4510小鼠略高于PS19小鼠，絲氨酸404位點(diǎn)的磷酸化水平rTg4510小鼠略低于PS19小鼠，詳見表2。

GroupNumberofcasesTau5pS199/202pS396/404Vector30.13±0.010.22±0.050.11±0.05Tau4031.56±0.02??1.00±0.13?1.00±0.17?P301L31.57±0.16?1.03±0.02?1.24±0.23?P301S31.54±0.11?1.48±0.34?1.42±0.04??F49.7208.0405.250P0.0010.0090.027 ?P<0.05,??P<0.01vsvectorgroup.

圖1 Western blotting法檢測(cè)HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染tau40、P301L和P301S質(zhì)粒后tau蛋白及磷酸化tau的表達(dá)Fig.1 Western blotting for tau and relative level of phosphorylated (p)-tau in tau40/P301L/P301S-plasmid transfected HEK293 cells

圖2 HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染tau40、P301L和P301S質(zhì)粒后微管形態(tài)的變化Fig.2 Changes of microtubules in tau40/P301L/P301S-plasmid transfected HEK293 cells (Scale bar=20 μm)

Representative images of immunofluorescence staining for β-tubulin labeled microtubules.

圖3 Western blotting法檢測(cè)tau蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)tau蛋白及磷酸化tau的表達(dá)Fig.3 Western blotting for tau and relative level of phosphorylated (p)-tau in tau transgenic mice models

nTg-1:negative transgenic control of rTg4510 mice;nTg-2:negative transgenic control of PS19 mice;PS19:transgenic mice model for P301S tau.

2.4 P301L和P301S轉(zhuǎn)基因小鼠中磷酸化tau蛋白免疫組織化學(xué)染色

應(yīng)用AT8抗體(識(shí)別Ser202/205位點(diǎn)磷酸化的tau蛋白)利用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)tau蛋白病理情況。在8月齡的rTg4510小鼠和PS19小鼠的內(nèi)嗅皮質(zhì)區(qū)域均顯示了AT8抗體的陽性。其中rTg4510小鼠的陽性細(xì)胞數(shù)量要多于PS19小鼠該區(qū)域的陽性細(xì)胞數(shù)量(圖4)。

GroupNumberofcasesTau5pS199/202pS396pS404nTg-140.29±0.040.43±0.060.32±0.050.37±0.11rTg451041.00±0.13??#1.00±0.10??1.00±0.13??1.00±0.17?nTg-240.20±0.010.28±0.050.29±0.050.61±0.06PS1940.65±0.03##0.79±0.12##0.81±0.05##1.24±0.15##F29.1914.5020.569.41P0.0010.0010.0010.002 nTg-1:negativetransgeniccontrolofrTg4510mice;nTg-2:negativetransgeniccontrolofPS19mice.PS19:transgenicmicemodelforP301Stau;?P<0.05,??P<0.01vsnTg-1group;##P<0.01vsnTg-2group;#P<0.05vsPS19group.

圖4 Tau蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)AT8免疫組織化學(xué)染色Fig.4 Immunohistochemistry staining of AT8 in the entorhinal cortex of tau transgenic mice models (Scale bar=100 μm)

Representative images of Immunohistochemistry staining of AT8 (against PHF-tau at Ser202/205) in the entorhinal cortex of tau transgenic mice models.nTg-1:negative transgenic control of rTg4510 mice;PS19:transgenic mice model for P301S tau;nTg-2:negative transgenic control of PS19 mice；PHF:paired helical filaments.

3 討論

在AD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中，tau蛋白受到了越來越多的關(guān)注，tau蛋白相關(guān)的機(jī)制研究和以tau蛋白為靶點(diǎn)治療AD及tau蛋白相關(guān)疾病成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。在tau蛋白在AD等相關(guān)疾病中的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，tau蛋白的過度磷酸化是導(dǎo)致病理改變最重要的原因[10]。tau蛋白的磷酸化主要通過兩個(gè)方面影響正常的生理功能。一方面tau蛋白的過度磷酸化可以降低tau蛋白與微管的正常結(jié)合，引起tau蛋白與微管結(jié)合能力降低和微管的解體[11]。另外一方面，tau蛋白從微管解離可以引起細(xì)胞內(nèi)游離tau蛋白增加，而過度磷酸化的tau蛋白則可以進(jìn)一步促進(jìn)游離tau蛋白的異常聚集[12]。Tau蛋白發(fā)生異常聚集后可以進(jìn)一步損傷微管和軸漿運(yùn)輸，影響細(xì)胞的正常生理功能[13]。

本研究分別應(yīng)用國際上比較認(rèn)可的tau蛋白轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，rTg4510轉(zhuǎn)基因小鼠(過表達(dá)～13倍于內(nèi)源性tau 的人P301L突變的4R0N-tau蛋白)以及PS19轉(zhuǎn)基因小鼠(過表達(dá)3～5倍于內(nèi)源性tau的人源P301L突變4R1N-tau蛋白)。首先在細(xì)胞模型中過表達(dá)了tau及P301位點(diǎn)突變的tau蛋白，引起tau蛋白水平以及tau蛋白磷酸化水平的增加，同時(shí)也導(dǎo)致微管的形態(tài)發(fā)生了改變，提示了過表達(dá)tau蛋白引起的tau蛋白過度磷酸化可能通過影響了微管的形態(tài)和生理功能，發(fā)揮毒性作用。同時(shí)，表達(dá)突變tau蛋白的細(xì)胞內(nèi)磷酸化水平及微管病變與野生型tau蛋白略有差異，提示突變tau蛋白可能會(huì)產(chǎn)生更大的毒性作用。突變tau蛋白會(huì)引起tau蛋白構(gòu)象等改變，進(jìn)而導(dǎo)致tau蛋白更易發(fā)生聚集或形成纏結(jié)，進(jìn)而產(chǎn)生tau蛋白病變[14]。因此，多個(gè)tau突變被用于構(gòu)建動(dòng)物模型，模擬tau蛋白引起的病理改變，其中以P301L/S突變構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠模型種類較多，表型相對(duì)明顯[15]。與之前研究[8]報(bào)道結(jié)果一致，本研究中rTg4510小鼠可以過表達(dá)tau蛋白，顯著高于對(duì)照組內(nèi)源tau的表達(dá)。同時(shí)，PS19小鼠tau蛋白表達(dá)量也顯著高于對(duì)照小鼠，且低于同月齡的rTg4510小鼠，這也與PS19過表達(dá)tau蛋白的量較低的報(bào)道[9，16-17]是一致的。在本研究檢測(cè)的磷酸化位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)基因小鼠的磷酸化水平均顯著高于轉(zhuǎn)基因陰性小鼠，但是不同位點(diǎn)的相對(duì)磷酸化水平的高低兩個(gè)小鼠略有差異，提示不同的突變類型可能造成不同位點(diǎn)的磷酸化水平產(chǎn)生差異。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建并表征了3個(gè)過表達(dá)tau及突變tau蛋白的細(xì)胞模型，繁育并檢測(cè)了兩個(gè)突變tau蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型。并通過檢測(cè)tau蛋白表達(dá)、tau蛋白磷酸化的水平以及微管的形態(tài)等初步比較了不同模型間的差異。通過本研究得到的結(jié)果，能夠?yàn)閠au蛋白及tau蛋白相關(guān)疾病的研究提供了可選擇的病理模型。