金鳳羽 阮祥燕,2* Alfred O. Mueck，2 杜 娟 李揚(yáng)璐 程姣姣 王虎生

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100026；2.德國圖賓根大學(xué)婦產(chǎn)醫(yī)院婦女健康部與婦女健康研究中心，圖賓根 D-72076，德國)

隨著人類醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和腫瘤治療學(xué)的發(fā)展，腫瘤患者的5年生存率有了很大的提高，年輕癌癥患者的5年生存率高達(dá)83%左右[1]。這些患者在腫瘤病痛緩解或治愈之后卻又常常面臨另外一個嚴(yán)峻的問題，在接受細(xì)胞毒性抗癌化學(xué)藥物治療或放射治療之后生育能力往往受到嚴(yán)重破壞，致使生活質(zhì)量受到很大影響，甚至不孕，家庭婚姻關(guān)系因此破裂者不在少數(shù)。因此，對這些女性患者，尤其是青春期前的進(jìn)行生殖力保護(hù)是非常重要和必要的。根據(jù)中國和德國婦產(chǎn)科協(xié)會(German Society of Gynecology and Obstetrics，DGGG)[2]在2018公布的指南，所有年輕惡性腫瘤患者應(yīng)同時接受腫瘤學(xué)家和生殖力保護(hù)專家的咨詢。

卵巢組織冷凍保存是保護(hù)女性生育能力的重要方法之一，是青春期前女孩或需要立即治療的患者的唯一可行選擇[3-4]。到2018年1月，根據(jù)報道[4]通過該項技術(shù)累計共有130多個嬰兒出生，且該數(shù)量呈幾何式上升。因此，Lambertini等[5]認(rèn)為卵巢組織凍存技術(shù)能夠很好地保護(hù)女性生殖力，因此不應(yīng)該再停留在實驗室階段而是廣泛應(yīng)用于臨床。

為了進(jìn)一步完善這種新型技術(shù)，提高臨床妊娠率，在凍存技術(shù)本身以及手術(shù)方面等方面展開了相關(guān)研究[6-8]，包括冷凍保存程序、凍存保護(hù)劑以及移植部位，然而卵巢組織復(fù)蘇后轉(zhuǎn)運(yùn)條件的研究鮮有報道。鑒于這種情況，本研究的主要目的是通過對復(fù)蘇后常溫情況下存放不同時間的卵巢組織進(jìn)行活性檢測，借此評估復(fù)蘇后的時間推移是否影響卵巢組織的活性。

1 材料與方法

1.1 材料

就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院，需要手術(shù)治療的卵巢腫瘤患者或需要進(jìn)行卵巢組織凍存以保護(hù)生殖力的患者共13名，經(jīng)患者知情同意后，腹腔鏡下冷刀取部分卵巢組織，置于康斯特保護(hù)液中(4 ℃)迅速轉(zhuǎn)運(yùn)到首都醫(yī)科大學(xué)北京婦產(chǎn)科醫(yī)院卵巢庫實驗室。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會審批，倫理審批號：2017-KY-020-1。在實驗室中，去除卵巢組織的髓質(zhì)和血管，僅保留皮質(zhì)部分，最后將卵巢組織制作成為直徑2 mm，厚度1 mm的圓形標(biāo)本，其中生殖力保護(hù)患者用于研究的卵巢組織不得超過取材總量的10%。每位患者共取標(biāo)本9個，采用數(shù)字表法隨機(jī)將其中1個新鮮標(biāo)本進(jìn)行卵泡計數(shù)，剩余的8個標(biāo)本進(jìn)行程序化冷凍。液氮中保存至少1周后進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇后按照常溫存放時間的不同分為4組，即組1(0 min)、組2(20 min)、組3(40 min)和組4(60 min)，每組2個標(biāo)本，置入含有培養(yǎng)液的24孔板中進(jìn)行獨(dú)立培養(yǎng)。4 d后收集培養(yǎng)液進(jìn)行雌激素、乳酸以及葡萄糖代謝濃度測定，卵巢組織標(biāo)本進(jìn)行卵泡計數(shù)。

1.2 程序化冷凍、復(fù)蘇培養(yǎng)

凍存液是由Leibovitz’s L-15(Gibco公司，美國)、1%(體積分?jǐn)?shù))人血清白蛋白(IrvineScience公司，美國)和10%(體積分?jǐn)?shù))CryoSure-DMSO(WAK-Chemie Medical GmbH)按照比例配置而成。卵巢組織標(biāo)本制作完成后，每2個標(biāo)本放入含有1.5 mL凍存液的無菌凍存管內(nèi)進(jìn)行程序化冷凍。冷凍程序參照文獻(xiàn)[9]。首先，將卵巢組織置入4 ℃凍存液中平衡15 min。然后將含有卵巢組織的無菌凍存管轉(zhuǎn)移到程序冷凍儀內(nèi)進(jìn)行程序化冷凍(PLANER，GDKRYO360CH-1.7-230)。降溫速度：在最初的5 min內(nèi)，降溫速度為2 ℃/min，待凍存管溫度降至-6 ℃時進(jìn)行人工誘導(dǎo)冰晶形成。然后按照0.5 ℃/min的速度繼續(xù)降溫至溫度達(dá)到-40 ℃，最后按照50 ℃/min的速度迅速降至-140 ℃。冷凍完成后將無菌凍存管轉(zhuǎn)移至-196 ℃液氮儲罐中儲存，7 d以后進(jìn)行復(fù)蘇。

復(fù)蘇液由9 mL DPBS(Gibco公司，美國)和1 mL人血白蛋白(IrvineScience公司，美國)組成。復(fù)蘇時對每位患者的8個標(biāo)本同時進(jìn)行復(fù)蘇。復(fù)蘇過程：①取出儲存在液氮罐內(nèi)的凍存管，置于37 ℃的水浴箱中2 min。②從凍存管內(nèi)取出卵巢組織標(biāo)本，依次轉(zhuǎn)移到6孔板中進(jìn)行洗滌、平衡。前3孔每孔內(nèi)含復(fù)蘇液10 mL，蔗糖含量分別為(0.75、0.45、0.125 mol/L)，每隔15 min將卵巢組織標(biāo)本轉(zhuǎn)移至下一個孔內(nèi)，共3次。第4孔和第5孔內(nèi)僅含復(fù)蘇液，不包含蔗糖。卵巢組織在第4孔內(nèi)平衡10 min后轉(zhuǎn)移至第5孔內(nèi)繼續(xù)平衡。5 min后復(fù)蘇完成。

在復(fù)蘇完成后的第0、20、40、60 min時采用數(shù)字表法隨機(jī)選取2個卵巢組織標(biāo)本轉(zhuǎn)移至含有1 mL培養(yǎng)液的24孔板內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立培養(yǎng)。培養(yǎng)液由90%(體積分?jǐn)?shù))DMEM(4.5 g/L D-glucose)和10%(體積分?jǐn)?shù))人血白蛋白按照比例配置而成。培養(yǎng)箱溫度37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2，95%濕度。4 d后收集培養(yǎng)液測定其中雌激素、孕激素、乳酸的濃度，卵巢組織進(jìn)行卵泡計數(shù)。

1.3 卵泡計數(shù)及雌激素、乳酸和葡萄糖測定

由于鈣黃素AM(calcein AM)只能在活細(xì)胞中才能被轉(zhuǎn)化為熒光鈣黃素，并產(chǎn)生熒光綠色染色。因此，本研究采用Calcein AM(美國Sigma公司)對卵巢組織進(jìn)行染色后在495 nm熒光顯微鏡下觀察，對所有活性卵泡進(jìn)行計數(shù)。

本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法測定培養(yǎng)液內(nèi)的雌激素的濃度，采用比色法/吸收法測定乳酸以及葡萄糖濃度。雌激素測定試劑盒購自德國DRG公司，乳酸及葡萄糖測定試劑盒購自美國Biovision公司。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。就卵泡計數(shù)而言，新鮮卵巢組織組和復(fù)蘇后第0分鐘(組1)兩組之間的差異采用兩個獨(dú)立樣本的t檢驗或t’檢驗。為了確定時間變化是否會對卵泡活性以及卵巢組織整體活性產(chǎn)生影響，對復(fù)蘇后不同時間點(diǎn)4組的卵泡計數(shù)，雌激素、乳酸濃度和葡萄糖分別進(jìn)行了重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

收集2014年至2017年期間就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院的13名育齡期女性的卵巢組織，這些女性患有卵巢良性囊腫需要腹腔鏡手術(shù)治療或需進(jìn)行卵巢組織凍存。所有患者月經(jīng)規(guī)律，平均年齡(34±5.4)歲，其中宮頸癌9例，乳腺癌1例，卵巢囊腫1例。

2.2 卵泡計數(shù)比較

新鮮卵巢組織組和組1(復(fù)蘇后第0分鐘)的活性卵泡平均數(shù)為33.360±45.857和30.680±32.884。兩組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)蘇后不同時間點(diǎn)(復(fù)蘇后第0，20，40，60分鐘)卵泡計數(shù)無明顯下降，4組間進(jìn)行重復(fù)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

2.3 4組雌激素濃度比較

復(fù)蘇后4組培養(yǎng)液內(nèi)的雌激素平均濃度分別為5.231±0.637,5.121±0.734,5.042±0.991和5.895±1.106(pg/mL)，4組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

圖1 復(fù)蘇不同時間點(diǎn)熒光顯微鏡下及光學(xué)顯微鏡下卵泡(100×)Fig.1 Follicles at different time points after thawing under fluorescence and optical microscopy

ItemNumberofcaseGroup1Group2Group3Group4FPEstrogen/(pg·mL-1)135.231±0.6375.121±0.7345.042±0.9915.895±1.1060.8920.356Lactate/(mmol·L-1)133.931±8.6273.581±9.1043.265±0.4983.087±0.5560.2290.638Glucose/(ng·mL-1)1315.575±1.02016.040±1.35917.037±6.04218.081±9.1331.7590.220

Group1:0 min;Group2:20 min；Group3:40 min；Group4:60 min.

2.4 4組乳酸濃度比較

復(fù)蘇后隨著時間的推移，培養(yǎng)液內(nèi)的乳酸濃度呈下降趨勢，組1乳酸濃度最高為(3.931±8.627)mmol/L，組4最低為(3.087±0.556)mmol/L。但這4組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1，圖2。

2.5 4組葡萄糖濃度比較

培養(yǎng)液內(nèi)的葡萄糖濃度呈上升趨勢，組1葡萄糖濃度最低為(15.575±1.020)ng/mL，組4最高為(18.081±9.133)ng/mL，然而這種上升趨勢差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1，圖3。

3 討論

卵巢組織凍存為青春期前女性以及迫切需要進(jìn)行放射治療聯(lián)合化學(xué)藥物治療(以下簡稱放化療)的育齡期女性提供了保留生殖力的希望。但是由于這項技術(shù)從實驗室走向臨床的時間僅僅數(shù)十年，仍需要大量的相關(guān)研究和數(shù)據(jù)進(jìn)一步優(yōu)化，這不僅包括了最重要也是爭議最多的凍存方案，同時也應(yīng)該包括卵巢組織取材、卵巢組織凍存、卵巢組織復(fù)蘇以及卵巢組織再移植等所有環(huán)節(jié)中的可能影響因素，例如復(fù)蘇后的轉(zhuǎn)運(yùn)條件以及轉(zhuǎn)運(yùn)時間限制。然而截止到目前，卵巢組織凍存技術(shù)相關(guān)研究多數(shù)集中在凍存方案和凍存保護(hù)液方面，其他影響因素鮮有報道，亟待更多相關(guān)研究。

圖2 復(fù)蘇后4組乳酸濃度隨時間變化趨勢Fig.2 Trend of lactate levels with time after thawing

Group1:0 min after thawing;Group2:20 min after thawing;Group3:40 min after thawing;Group4:60 min after thawing.

圖3 復(fù)蘇后4組葡萄糖濃度Fig.3 Trend of glucose levels with time after thawing

Group1:0 min after thawing;Group2:20 min after thawing;Group3:40 min after thawing;Group4:60 min after thawing.

由于程序化卵巢組織凍存技術(shù)對實驗室設(shè)備和相關(guān)技術(shù)人員有一定水平的要求，因此在歐洲建議采取中心化管理模式[5]，其他一些地區(qū)的女性可以通過冷鏈等方式將卵巢組織轉(zhuǎn)運(yùn)到那些具有條件的醫(yī)院和實驗室進(jìn)行卵巢組織凍存，而復(fù)蘇后則要求盡快將卵巢組織移至體內(nèi)，實驗室和手術(shù)室需要近在咫尺，大大限制了這項技術(shù)的推廣。此外，手術(shù)本身是一件隨時可能意外的發(fā)生，如果卵巢組織如期復(fù)蘇完畢，而因為腹腔內(nèi)大量粘連、出血等因素導(dǎo)致移植部位不能在預(yù)期的時間內(nèi)完成準(zhǔn)備工作，可能會患者造成不可逆的損失。因此為了避免上述情況的發(fā)生，臨床工作中往往會選擇在確認(rèn)患者移植部位已經(jīng)準(zhǔn)備完畢后再啟動復(fù)蘇程序(整個復(fù)蘇過程至少1 h以上)，不可避免地延長了手術(shù)時間，增加了患者的負(fù)擔(dān)。然而該研究發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇后在常溫條件下，卵巢組織在1 h內(nèi)活性卵泡個數(shù)以及卵巢組織整體活性并沒有出現(xiàn)明顯下降，因此嚴(yán)格地等待患者移植部位手術(shù)準(zhǔn)備完畢再啟動復(fù)蘇程序很可能是不必要的。

卵泡計數(shù)是反應(yīng)卵巢組織活性的一個非常重要的指標(biāo)，本研究中在新鮮組和復(fù)蘇后組1(復(fù)蘇后第0分鐘)之間，復(fù)蘇后4組間卵泡計數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。然而卵泡計數(shù)評估卵巢組織活性存在著一定的缺陷，卵泡只有在嚴(yán)重受損后幾小時才會出現(xiàn)組織改變并能被現(xiàn)有得檢測技術(shù)所檢測出來[9]，因此卵泡計數(shù)以及完整性并不能完全地反映組織真正的受損情況，仍需要結(jié)合其他指標(biāo)進(jìn)行評估卵巢組織整體活性[10-12]。雌激素是由活性卵泡分泌產(chǎn)生的一種類固醇激素，通過測定培養(yǎng)液內(nèi)雌激素的濃度可以在很大程度上反映出組織中卵泡的活性情況，從而彌補(bǔ)單純卵泡計數(shù)評價卵巢組織活性的不足[11]。乳酸以及葡萄糖代謝的測定可以用于評估復(fù)蘇后卵巢組織整體活性情況，乳酸濃度越低提示卵巢組織活性下降越嚴(yán)重。反之，葡萄糖濃度越高提示組織對葡萄糖的攝取越少，意味著組織活性越差[13]。在本研究中，對復(fù)蘇后4組培養(yǎng)液內(nèi)的雌激素、乳酸以及葡萄糖濃度進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，均提示復(fù)蘇后的卵巢組織在短時間內(nèi)無論是卵泡計數(shù)還是組織整體活性情況都沒有發(fā)生明顯下降。但由于受樣本量的限制，本項研究僅對復(fù)蘇后1 h內(nèi)的卵巢組織活性進(jìn)行評估，沒有發(fā)現(xiàn)明顯下降。然而復(fù)蘇后等待時間繼續(xù)延長，卵巢組織的活性是否會下降尚無可預(yù)知，仍需進(jìn)一步研究。此外，本研究僅對能卵巢組織活性的幾個重要指標(biāo)進(jìn)行了觀測，是否會影響再移植卵巢組織存活仍需臨床進(jìn)一步驗證。復(fù)蘇后常溫條件下卵巢組織在1 h內(nèi)卵泡計數(shù)無顯著性減少，卵巢組織整體活性無顯著性下降。