鄧六愛，張念英，郭 冰，禚歡歡，楊曉敏

（日照市食品藥品檢驗檢測中心，山東日照 276800）

0 引言

茶是一種社會公認(rèn)的健康飲品。在茶葉中禁止使用合成著色劑，但仍有許多不法生產(chǎn)商在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，通過添加合成著色劑改變茶葉及茶湯色澤，以次充好，以陳茶冒充新茶。合成著色劑主要是通過化學(xué)合成的方法制得的有機(jī)色素[1]。因色彩鮮艷、著色力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低等特點受到食品加工業(yè)的青睞，但其不僅不能向人體提供所需營養(yǎng)，并且具有慢性毒性和強(qiáng)致癌性，危害人體健康[2]。我國GB 2760—2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[3]規(guī)定了食品中允許使用的合成著色劑的種類、使用范圍、最大使用量。

目前合成著色劑的檢測方法主要有分光光度法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法（TLC）、極譜法、高效液相色譜法[4-6]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]等。目前對茶葉中合成著色劑的檢測參照GB 5009.35—2016[9]食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中合成著色劑的測定進(jìn)行，但此方法樣品前處理基質(zhì)不包括茶葉，沒有針對性，在前處理和目標(biāo)組分定量方面還存在一定問題，無法滿足實際檢測需要。該方法對標(biāo)準(zhǔn)中前處理方法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了一種同時測定茶葉中6種合成著色劑的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司產(chǎn)品；3-18KS型高速冷凍離心機(jī)，德國SIGMA公司產(chǎn)品；EVAP-45型水浴氮氣吹干儀，美國Organomation公司產(chǎn)品；Pressure+48型固相萃取真空裝置 （Biotage）；R-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑

（1）標(biāo)準(zhǔn)品。檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)（0.500 mg/mL），中國計量科學(xué)研究院提供；新紅（100 mg/L），農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所提供。

（2） 試劑。甲醇（色譜純，CNW）；乙腈（色譜純，CNW）；甲酸（色譜純，CNW）；乙酸乙酯（色譜純，CNW）；乙酸銨（色譜純，CNW）；正己烷（色譜純，CNW）；其他試劑為分析純；所有試驗用水為一級水。

1.2 試驗條件

色譜柱：C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30℃，檢測波長范圍：二極管陣列檢測器波長范圍400～800 nm，或紫外檢測器檢測波長254 nm。

流動相：梯度洗脫；20 mmol/L乙酸銨溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脫程序：0 min，A為95%，B為5%；1 min，A為95%，B為5%；8 min，A為65%，B為35%；10 min，A為20%，B為80%；16 min，A為20%，B為80%；18 min，A為85%，B為15%；20 min，A為95%，B為5%。

1.3 試驗方法

茶葉樣品經(jīng)粉碎后備用。準(zhǔn)確稱取2 g（精確到0.001 g） 試樣于50 mL離心管中，加入20 mL氨水-70%甲醇水（1∶99），渦旋混合2 min，超聲提取10 min，以轉(zhuǎn)速6 500 r/min離心5 min，上清液移入旋蒸瓶中。殘渣加入10 mL氨水-70%甲醇水（1∶99）再提取1次，合并2次上清液。將上清液在40℃水浴條件下，減壓濃縮至約15 mL，加入3 mL甲酸混勻，制成待凈化液。

將待凈化液移入處理好的固相萃取柱中，待樣液完全流出后，加入5 mL甲醇進(jìn)行淋洗，棄去全部流出液；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的氨水甲醇溶液5 mL進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。將洗脫液在50℃下氮吹濃縮至近干，用 1.0 mL流動相溶解殘渣，過0.45 μm濾膜，置于高效液相色譜儀測定。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

量取適量的檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品，配制成各含有1.00，2.00，5.00，10.0，20.0，50.0，100.0 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于高效液相色譜儀進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品前處理條件優(yōu)化

分別對樣品的提取溶液、固相萃取柱、淋洗液、洗脫液進(jìn)行優(yōu)化，以樣品的加標(biāo)回收率檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3.3 準(zhǔn)確性和重復(fù)性

以市售茶葉為空白基質(zhì)，加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.5，3.0，15.0 mg/kg選擇優(yōu)化后的前處理條件進(jìn)行操作，計算回收率和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法優(yōu)化[10-13]

2.1.1 提取方法的選擇

對于合成著色劑檢測，最常用提取方式為聚酰胺吸附法，方法步驟繁瑣、耗時長，容易造成吸附不完全，特別在用于茶葉提取時，合成著色劑無法完全吸附，還會造成其他雜質(zhì)過度富集，造成樣品上機(jī)干擾大、回收率低。因此，試驗溶劑提取后，采用固相萃取柱凈化進(jìn)行樣品前處理。

2.1.2 SPE柱選擇

茶葉的基質(zhì)復(fù)雜，要同時分析多種合成著色劑組分，僅靠液液分配很難除去干擾物質(zhì)。且茶葉提取后的溶液體積較大，含有雜質(zhì)較多，需進(jìn)行凈化和濃縮富集。因此，選用固相萃取柱對提取液進(jìn)一步凈化，除去與合成著色劑性質(zhì)相似的干擾物。

用于合成著色劑檢測的SPE凈化柱主要有氧化鋁凈化柱，C18，HLB，MAX，WAX凈化。試驗選取Proelut PWA-2（混合型弱陰離子）、聚酰胺粉、HLB（N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯親水親脂平衡性填料，通用型凈化柱）、PWAX（混合型弱陰離子）等幾種不同填料的固相萃取柱，在試樣中添加國標(biāo)2倍定量限水平3.0 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行3次平行試驗，通過平均回收率比較幾種固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果表明，Proelut PWA-2柱進(jìn)行凈化效果最好。

不同固相萃取凈化回收率結(jié)果見表1。

表1 不同固相萃取凈化回收率結(jié)果

2.1.3 提取溶劑的選擇

一個合適提取劑需要使基質(zhì)干擾最小并且能有效提取目標(biāo)物，同時不帶來新的污染。參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-13]后，分別選擇乙醇-乙腈-水-氨水、乙腈 -水 （2∶1）、氨水 -70%甲醇水 （1∶99）、乙醇-水-10%氨水（7∶2∶1） 作為提取溶劑進(jìn)行研究比較，考查在試樣中添加含量均為3.0 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的茶葉樣品，進(jìn)行平行3次試驗，通過平均回收率結(jié)果比較幾種提取溶劑的提取效果。

試驗表明，乙醇-乙腈-水-氨水、乙腈-水（2∶1）、氨水-70%甲醇水（1∶99） 均能提取出茶葉中的合成著色劑。其中，氨水-70%甲醇水提取效果比乙醇-乙腈-水-氨水、乙腈-水（2∶1） 提取溶劑好，并且有機(jī)溶劑用量少，回收率高、雜質(zhì)少、無干擾峰。因此，試驗采用氨水-70%甲醇水（1∶99） 作為提取溶劑。

不同提取溶劑回收率結(jié)果見表2。

表2 不同提取溶劑回收率結(jié)果

2.1.4 淋洗液選擇

淋洗液的主要作用是將吸附在固相萃取柱上雜質(zhì)洗掉。參考相關(guān)文獻(xiàn)[14-15]，試驗選取甲醇、2%甲酸水、甲醇-甲酸-水作為淋洗液。結(jié)果表明，采用添加甲酸的淋洗液，目標(biāo)物亮藍(lán)回收率低。因此只采用甲醇淋洗，既能洗滌去較多雜質(zhì)且保證不會使目標(biāo)組分被洗掉，洗滌效果好、回收率高。

不同淋洗液回收率效果見圖1。

圖1 不同淋洗液回收率效果

2.1.5 洗脫液選擇

洗脫液目前國家標(biāo)準(zhǔn)中均采用氨水甲醇溶液，對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液洗脫效果進(jìn)行比較。選取5%氨水甲醇、10%氨水甲醇、15%氨水甲醇、20%氨水甲醇進(jìn)行洗脫，試驗表明，當(dāng)氨水質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低時，幾種著色劑洗脫均不太完全，回收率偏低。氨水質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到20%時回收率相差不大。采用15%氨水甲醇即能夠快速且完全將固相萃取柱中合成著色劑洗脫下來，達(dá)到良好回收。故選擇15%氨水甲醇作為洗脫液。

2.2 工作曲線、線性范圍及檢出限的確認(rèn)

試驗配制質(zhì)量濃度為1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00，100.00 μg/mL的6種合成著色劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定色譜條件下進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到6種合成著色劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限。結(jié)果表明，6種合成著色劑在1.00～100.00 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 4～0.999 8。

采用空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分，采用優(yōu)化后方法進(jìn)行前處理后上機(jī)，用信噪比法確定方法檢出限（LOD） 和定量限（LOQ），6種目標(biāo)組分的LOD和LOQ 分別為 0.02～0.08，0.07～0.25 mg/kg。

6種著色劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（LOD）、定量限（LOQ） 見表3。

表3 6種著色劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）

2.3 準(zhǔn)確度和重復(fù)性

選用不添加目標(biāo)化合物的茶葉作為空白基質(zhì)做加標(biāo)回收和精密度試驗，樣品質(zhì)量濃度為1.5，3.0，15 mg/kg 3個標(biāo)準(zhǔn)，按該方法進(jìn)行前處理和測定，每種質(zhì)量濃度平行測定6次，6種著色劑加標(biāo)回收率在71.3%～85.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，方法的回收率和精密度滿足檢測要求。

6種合成著色劑的加標(biāo)回收率及精密度（n=6）見表4。

表4 6種合成著色劑的加標(biāo)回收率及精密度（n=6）

3 結(jié)論

該方法與GB 5009.35—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中合成著色劑的測定相比，對樣品的前處理方法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了茶葉中6種合成著色劑的高效液相色譜檢測方法，該方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，線性關(guān)系、精密度和準(zhǔn)確度均獲得滿意的結(jié)果，能更好地滿足茶葉中合成著色劑的檢測，具有較高的實用價值。