陳國枝 儲炬

(華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237)

頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)是β-內(nèi)酰胺類抗生素的主要工業(yè)生產(chǎn)菌，其發(fā)酵產(chǎn)物頭孢菌素C(CPC)經(jīng)過化學法或者酶法處理可獲得7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)[1]，后者是合成各種頭孢類抗生素藥物的母核物質(zhì)。2014年，Dominik等[2]公布了頂頭孢霉野生型菌株ATCC11550的全基因組序列，使得從分子層面研究頂頭孢霉基因功能更加便利。

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法是頂頭孢霉中最為成熟的遺傳操作方法。然而，由于頂頭孢霉細胞結(jié)構(gòu)復雜、分生孢子量比較少[3]等特性，其原生質(zhì)體制備較為繁瑣、困難。同時，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率低下，使得頂頭孢霉分子研究進程緩慢。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法依賴于根癌農(nóng)桿菌的侵染性，會將自身體內(nèi)的Ti質(zhì)粒的一部分基因轉(zhuǎn)移并整合到宿主菌內(nèi)。由于該方法轉(zhuǎn)化對象多樣，宿主菌可以是孢子、菌絲體以及原生質(zhì)體等，操作簡便，轉(zhuǎn)化效率也相對較高，逐漸成為真菌基因操作的常用手段[4]。

聚酮合酶(PKS)負責聚酮化合物主鏈的合成。其中I型PKS基于其β-酮的還原程度可分為：非還原型(NR)PKS、高度還原型(HR)PKS和部分還原型(PR)PKS。真菌聚酮化合物結(jié)構(gòu)復雜多樣，具有廣泛的生產(chǎn)應用價值，如可降低膽固醇的洛伐他丁等。

Sorbicillinoids是頂頭孢霉產(chǎn)生的黃色色素，它是一類環(huán)酮類化合物，屬于次級代謝產(chǎn)物。由于其廣泛的生物活性譜，它在抗氧化、抗癌等方向具有很大的應用潛力[5]。該物質(zhì)存在于很多真菌中，如產(chǎn)黃青霉[6]、里氏木霉[7]等。在產(chǎn)黃青霉中有負責sorbicillinoids合成的PKS基因簇，Guzmán-Chávez等[6]通過對該基因簇中單基因敲除研究后發(fā)現(xiàn)，該基因簇中有一對反向排列的聚酮合酶，分別為HR PKS(sorA,Pc21 g05080)和NR PKS(sorB,Pc21 g05070)，負責合成sorbicillinoids的骨架結(jié)構(gòu)，敲除兩個基因中的任意一個都會造成sorbicillinoids的缺失。目前該物質(zhì)只能在很多野生型菌株中分離出來，青霉素高產(chǎn)菌如Wisconsin 54-1255不能產(chǎn)生sorbicillinoids[8]，高產(chǎn)的頂頭孢霉1-D1菌株呈白色，根據(jù)表型可以判斷該菌株也無法合成該物質(zhì)。同時實驗表明，在傳統(tǒng)菌株改良過程中，相對高產(chǎn)的產(chǎn)黃青霉的次級代謝基因轉(zhuǎn)錄圖譜顯示PKS基因簇被沉默了[9]。以上種種跡象表明sorbicillinoids缺失和CPC產(chǎn)量提高之間存在聯(lián)系。

基于此，本研究采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法高效了構(gòu)建野生型頂頭孢霉sorbicillinoids的缺失菌株，同時敲除sorA和sorB，考察色素sorbicillinoids和頂頭孢霉產(chǎn)量之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

野生型頂頭孢霉CGMCC 3.3795購于中國普通微生物菌種保藏管理中心；大腸埃希菌DH5α、農(nóng)桿菌AGL-1和潮霉素表達載體pAN7-1均由本實驗室保存；pAg1-H3由北京中科院劉剛老師饋贈。

1.2 儀器與試劑

主要儀器有HP1100液相色譜(Agilent有限公司)；Nanodrop 2000型核酸定量儀(美國Thermo公司)；MicroPluser型電轉(zhuǎn)化儀。

真菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自Axygen公司；限制性內(nèi)切酶、Taq酶等購自大連Takara公司；一步克隆法試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；抗性篩選標記購自于生工生物工程(上海)股份有限公司，測序工作也由該公司完成。

1.3 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基

農(nóng)桿菌與頂頭孢霉共轉(zhuǎn)化基本培養(yǎng)基(MM)、誘導培養(yǎng)基(IM)參見文獻[10]，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法以及產(chǎn)物HPLC檢測方法參考文獻[11]，TSA培養(yǎng)基參考文獻[12]。大腸埃希菌、AGL-1及頂頭孢霉培養(yǎng)過程根據(jù)需要加入抗生素。

1.4 同源臂擴增

在產(chǎn)黃青霉中，負責合成sorbicillinoids的基因簇一共包含7個基因(Pc21 g05110-Pc21 g05050)[6]。通過NCBI的蛋白數(shù)據(jù)庫，對產(chǎn)黃青霉中該基因簇上相關(guān)蛋白進行BLASTP檢索，找到頂頭孢霉野生型ATCC11550中對應的基因簇并確定表達SorA和SorB蛋白的兩個基因。設(shè)計兩對引物(pksup-F,pksup-R)和(pksdown-F,pksdown-R)，通過真菌基因組DNA提取試劑盒提取野生型頂頭孢霉CGMCC3.3795的基因組，以其為模板，分別擴增同源臂上游sorB和下游sorA基因中的片段。擴增得到單一條帶后連接T載體送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.5 載體的構(gòu)建

將上下游同源片段與擴增后的表達載體pAg1-H3用一步克隆法相連接，得到pAg1-up-down質(zhì)粒。將質(zhì)粒進行KpnI單酶切回收，與擴增出的pAN7-1中潮霉素抗性表達片段進行一步克隆法連接，構(gòu)建質(zhì)粒pAg1-?pks。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑選4個單菌落，對hph抗性編碼區(qū)進行菌落PCR驗證。對初步驗證成功的質(zhì)粒進行測序。載體構(gòu)建流程見圖1，所需引物見表1。

1.6 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

使用電擊轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pAg1-?pks轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL-1的感受態(tài)中。取0.2μg pAg1-?pks，將其與100μL農(nóng)桿菌感受態(tài)混合冰浴30min，加入預冷的間距為1mm的電擊轉(zhuǎn)化杯中，電擊轉(zhuǎn)化(2400V場強，200Ω并聯(lián)電阻，25μF電容器)。電擊結(jié)束后立即加入900μL無抗LB，吹打吸取混合液，置于2mL離心管，28℃、100r/min下孵育2h。吸取液體，涂在含有對應抗生素的LB固體培養(yǎng)2d后，隨機挑取至含抗LB液體中培養(yǎng)，PCR進行驗證。

1.7 共培養(yǎng)

將轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)接至IM培養(yǎng)基中，待其A600為0.6左右時，與107個/mL的頂頭孢霉孢子懸液等量混合。將混合液涂布與貼有Whatman Grade 542濾紙的IM平板中，置于24℃避光培養(yǎng)3d，然后將濾紙轉(zhuǎn)移到含有100μg/mL潮霉素和200μmol/mL頭孢噻肟的TSA篩選板中。28℃培養(yǎng)5d左右。挑取肉眼可見的白色菌落，轉(zhuǎn)接至含有潮霉素的固體平板中，連續(xù)傳代3次。

圖1 載體pAg1-?pks構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction fl owchart of pAg1-?pks

表1 試驗所需引物Tab.1 Primers used in this research

1.8 轉(zhuǎn)化子的PCR驗證

挑取傳代后仍為白色的菌落，使用真菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組，以其為模板，通過4組引物進行PCR驗證。驗證正確后，擴增轉(zhuǎn)化子的抗性表達片段，連接T載體后測序。

2 結(jié)果

2.1 同源臂擴增結(jié)果

通過蛋白序列的比對，發(fā)現(xiàn)頂頭孢霉野生菌ATCC 11550中負責表達sorbicillinoids的基因簇一共包含8個基因(ACRE_048110- ACRE_048180)。其中有兩個反向排列的基因，sorA(ACRE_048180)以及sorB(ACRE_048170)分別編碼兩個聚酮合酶，是合成sorbicillinoids的關(guān)鍵基因。因此實驗設(shè)計敲除質(zhì)粒，將潮霉素篩選標記連接至上下游同源片段中間，依據(jù)同源交換原理，敲除sorA以及sorB的部分編碼基因，構(gòu)建缺失菌株。載體的構(gòu)建過程見圖1。缺失菌的鑒定原理如圖2所示，根據(jù)同源雙交換的原理，抗性基因整合到了真菌基因組上。因此設(shè)計不同的引物可以擴增得到不同的片段，可用于缺失菌的鑒定。

圖2 缺失菌鑒定示意圖Fig.2 Identification illustration of the mutants

依據(jù)序列設(shè)計并合成兩對PCR引物，分別為用于擴增同源臂上游sorB基因中2105bp片段，以及下游sorA基因中2202bp片段。擴增結(jié)果如圖3所示，其大小符合預期。同時，測序結(jié)果與GenBank公布的基因一致。這也表明頂頭孢霉ATCC11550菌株與CGMCC 3.3795菌株的這兩個基因序列無差別。

圖3 pks上下游同源臂PCR結(jié)果Fig.3 PCR amplification of pks upstream and downstream

2.2 載體構(gòu)建結(jié)果

用KpnI單酶切驗證pAg1-up-down質(zhì)粒。如圖4A所示，單酶切后pAg1-up-down 質(zhì)粒長度在7500～10000bp之間，符合實驗預期結(jié)果。將線性化的質(zhì)粒與潮霉素抗性表達片段進行連接，轉(zhuǎn)入DH5α后，挑取4個單菌落進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，擴增hph抗性編碼區(qū)，即1020bp。如圖4B所示，電泳結(jié)果表明擴增片段長度均符合預期。隨機選擇其中1個質(zhì)粒進行測序，驗證無誤，表明pAg1-?pks質(zhì)粒構(gòu)建完成。

2.3 轉(zhuǎn)化子驗證結(jié)果

圖4 電泳圖譜驗證Fig.4 Electrophoresis pattern verification

通過電擊轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，將農(nóng)桿菌與頂頭孢霉孢子共培養(yǎng)，抗性篩選得到轉(zhuǎn)化子。挑選肉眼可見的變白的轉(zhuǎn)化子，進行PCR驗證。PCR驗證原理以及PCR產(chǎn)物電泳圖分別見圖2和圖5。兩個聚酮合酶基因的缺失，會導致sorbicillinoids合成的阻斷。如圖2所示，以T1/T2擴增野生型頂頭孢霉同源交換片段，以T3/T4擴增缺失菌中的抗性表達片段，以T5/T6擴增同源臂以及啟動子片段，以T7/T8擴增終止子及下游同源臂片段。同時以T5/T8擴增時，野生菌和缺失菌均能擴增出片段，但是片段長度不同，可以用于確認是否轉(zhuǎn)化成功。PCR結(jié)果顯示，1～5號轉(zhuǎn)化子的擴增片段和預期一樣，6號轉(zhuǎn)化子除T3/T4擴增結(jié)果不合預期外，其余都符合預期。從圖5擴增結(jié)果可以看出，缺失菌基因組擴增大小明顯區(qū)別于野生菌，符合同源雙交換結(jié)果。將該擴增片段連接T載體后測序，測序結(jié)果表明，實驗篩選得到雙交換同時敲除sorA和sorB的菌株A.chrysogenum-?pks。

通過表型挑選出的6株白色菌落，測序驗證發(fā)現(xiàn)都是成功進行雙交換的缺失菌。可以判定，呈現(xiàn)白色的菌落基本都是缺失突變株。挑選任意一個轉(zhuǎn)化平板，如圖6。已圈出的為5個白色菌落是缺失突變株，19個黃色菌落為野生菌，由此計算出本實驗系統(tǒng)的基因缺失效率高達20%左右。

2.4 產(chǎn)量比較

為分析色素sorbicillinoids的缺失對CPC產(chǎn)量的影響，將其中1個突變株和野生菌株同時進行液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。先將菌株在搖瓶種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d之后，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中先28℃培養(yǎng)3d，然后將培養(yǎng)溫度調(diào)到25℃培養(yǎng)5d。每隔24h取樣分析其發(fā)酵產(chǎn)量。液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)過程及HPLC測定CPC濃度條件參見文獻[11]。

HPLC結(jié)果顯示，野生菌在第5天達到CPC產(chǎn)量的最高點，為0.36mg/mL，之后效價慢慢下降，在發(fā)酵第7天的效價只有0.33mg/mL。在發(fā)酵第7天的時候，缺失突變株的CPC產(chǎn)量達到最大值，為0.56mg/mL，比野生型菌株提高了70%。這表明，色素sorbicillinoids的缺失會提高CPC產(chǎn)量的影響。

3 總結(jié)

圖5 缺失突變株的PCR驗證Fig.5 PCR verification of pks deletion mutants

圖6 抗性板篩選缺失突變株Fig.6 Screening of pks deletion mutants on plate

圖7 缺失突變株及野生菌的CPC產(chǎn)量Fig.7 CPC production in pks deletion mutant and the wild-type strain

傳統(tǒng)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法中，原生質(zhì)體制備困難，再生率低下，導致轉(zhuǎn)化效率低下，耗時費力，使得頂頭孢霉分子研究進程緩慢。Xu等[13]建立的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化平臺，但是其轉(zhuǎn)化對象為頂頭孢霉原生質(zhì)體，操作同樣費時費力。本實驗采用了農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化對象為孢子而非原生質(zhì)體，操作簡單，效率高，可以為頂頭孢霉提供更為方便的分子構(gòu)建平臺。

Sorbicillinoids是一種次級代謝產(chǎn)物。通過Blast發(fā)現(xiàn)，在頂頭孢霉中有一個聚酮合酶基因簇，共8個基因，負責其生物合成。本實驗構(gòu)建A.chrysogenumpks菌株，同時敲除了sorA和sorB基因，切斷了次級代謝產(chǎn)物sorbicillinoids的合成途徑，節(jié)約了代謝能量，其CPC產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了70%。這不僅為CPC產(chǎn)量提高提供一個策略，也為后續(xù)深入研究sorbicillinoids的代謝調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。