王 玨， 徐 溯， 吳 湜， 楊 洋， 劉 楊

甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（金葡菌）（MRSA）是重要的醫(yī)院感染病原體之一，且近年逐漸向社區(qū)蔓延[1]。萬古霉素是治療MRSA侵襲性感染的一線用藥，但萬古霉素中介金葡菌（VISA）和異質(zhì)性萬古霉素中介金葡菌（hVISA）漸見增多[2]。磷霉素單獨(dú)或聯(lián)合用藥成為治療MRSA感染的一種選擇[3]。然而，隨著磷霉素的廣泛應(yīng)用，磷霉素耐藥MRSA菌株也在臨床出現(xiàn)，郭燕等[4]報(bào)道2010年我國MRSA磷霉素耐藥率達(dá)到29.5% 。

磷霉素分子結(jié)構(gòu)與6-磷酸葡萄糖（G-6-P）和3-磷酸甘油（G-3-P）類似，可分別通過兩者的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)UhpT和GlpT轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞質(zhì)，繼而與磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移酶（MurA）不可逆結(jié)合，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的初始階段，殺滅細(xì)菌[5]。細(xì)菌對(duì)磷霉素耐藥的常見機(jī)制包括：產(chǎn)生磷霉素修飾酶Fos；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白UhpT和GlpT變異；靶蛋白MurA變異等。本院前期研究表明磷霉素耐藥MRSA菌株中fos基因和murA基因突變率很低，多數(shù)murA突變與磷霉素耐藥無明顯相關(guān)性，而glpT和uhpT突變率較高[6]。敲除uhpT和glpT基因可導(dǎo)致金葡菌對(duì)磷霉素耐藥性升高，而菌株uhpT的轉(zhuǎn)錄水平似與其磷霉素敏感性相關(guān)[7]。

文獻(xiàn)報(bào)道，uhpT的表達(dá)受hptRSA三組分調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控[8]，hptR、hptS、hptA3個(gè)基因構(gòu)成了此調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，其中HptA可感知胞外G-6-P，激活下游hptRS系統(tǒng)，進(jìn)而上調(diào)uhpT基因的表達(dá)；敲除hptRS基因后可引起細(xì)菌的磷霉素最低抑菌濃度（MIC）顯著上升[9]。而hptA基因是否影響細(xì)菌磷霉素耐藥性尚不明確；臨床分離的MRSA中，hptRSA基因是否影響細(xì)菌磷霉素藥敏亦不明確。本研究擬通過對(duì)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院臨床無菌體液分離的MRSA進(jìn)行磷霉素MIC測(cè)定，檢測(cè)耐藥相關(guān)基因的突變，分析了解hptRSA基因變異在MRSA磷霉素耐藥性形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2004－2014年我院住院患者血液和腦脊液分離得到的MRSA（剔除同一患者分離得到的重復(fù)菌株）共50株。其中血液40株，腦脊液10株。經(jīng)純分、16S rRNA測(cè)序及頭孢西丁紙片法藥敏鑒定確認(rèn)為MRSA菌株后，甘油肉湯-80 ℃凍存。藥敏測(cè)定質(zhì)控菌株為金葡菌ATCC 29213。

1.1.2 主要試劑及儀器 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（BHIA）和MH瓊脂培養(yǎng)基為英國OXOID公司產(chǎn)品；磷霉素等抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品購自上海東方藥品科技實(shí)業(yè)有限公司；G-6-P購自Sigma公司；溶葡酶、瓊脂糖購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；金葡菌專用裂解液為上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院金姝醫(yī)師專利產(chǎn)品（專利號(hào)：ZL201310124795.2）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；DNA抽提試劑盒、PCR試劑購自TaKaRa公司。PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品；A400多點(diǎn)接種儀、接種針和接種板為英國Denley公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥敏測(cè)定 以瓊脂稀釋法測(cè)定苯唑西林對(duì)50株MRSA的藥敏，按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2017年標(biāo)準(zhǔn)判讀[10]。磷霉素對(duì)50株MRSA的MIC測(cè)定和判斷標(biāo)準(zhǔn)參照2019年歐洲共同體藥敏試驗(yàn)委員會(huì)（EUCAST）標(biāo)準(zhǔn)（MIC≤32 mg/L為敏感折點(diǎn)）[11]。磷霉素MIC測(cè)定時(shí)，瓊脂培養(yǎng)基中含25 mg/L的G-6-P。

1.2.2 DNA模板制備 挑取1～2個(gè)菌落，加入3 mL TSB過夜培養(yǎng)后，離心獲得菌體沉淀，加入100 μL金葡菌專用裂解液及7 μL溶葡酶56℃金屬浴50 min。根據(jù)TaKaRa DNA抽提試劑盒步驟提取細(xì)菌基因組DNA，獲得的DNA抽提物稀釋100倍用作fosB、glpT、uhpT、hptR、hptS及hptA基因的普通PCR模板。

1.2.3 磷霉素耐藥相關(guān)基因序列分析fosB、glpT、uhpT引物及PCR條件參照傅祝英杰等[12]的前期研究。hptR、hptS及hptA引物為自行設(shè)計(jì)，使用NCBI primer-blast工具，根據(jù)GenBank金葡菌Newman菌株序列中hptR、hptS、hptA基因及周邊序列設(shè)計(jì)引物，見表1。PCR擴(kuò)增hptR、hptS、hptA基因，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步測(cè)序。PCR條件：所有基因94℃預(yù)變性5 min，退火30 s，延伸溫度72 ℃，循環(huán)數(shù)35個(gè)。退火溫度和延伸時(shí)間見表 1。測(cè)序后與 GenBank數(shù)據(jù)金葡菌Newman序列（Accession number：NC_009641）比對(duì)，確認(rèn)變異位點(diǎn)，并將相應(yīng)變異位點(diǎn)命名。變異位點(diǎn)命名邏輯參考Fu等[13]對(duì)uhpT和glpT基因變異的命名方式：變異位點(diǎn)若僅在磷霉素耐藥株中出現(xiàn)，則依次使用英文字母命名為TypeA、TypeB、TypeC；變異位點(diǎn)若在磷霉素敏感株和耐藥株中均存在，則使用羅馬字母依次命名為TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ；采用角標(biāo)標(biāo)注變異基因名稱。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

5 0株M R S A的苯唑西林M I C值范圍為3 2～2 5 6 m g/L。磷霉素的M I C值范圍為1～＞1 024 mg/L；其中磷霉素耐藥株34株，敏感株16株。耐藥株多呈高水平耐藥，21株MIC＞1 024 mg/L，3株MIC=512 mg/L，1株MIC=256 mg/L，3株MIC=128 mg/L。

表1 hptRSA PCR 引物及反應(yīng)條件Table 1 PCR primers and reaction conditions used to amplify hptRSA genes in this study

表2 hptR、hptS、hptA 突變類型與相應(yīng)菌株磷霉素MIC范圍Table 2 Types of hptR，hptS and hptA mutation and fosfomycin minimum inhibitory concentration range

2.2 hptR 、hptS、hptA突變情況與磷霉素MIC

50株菌中，除所有同義突變外，hptR基因突變類型主要有3類，皆導(dǎo)致HptR肽鏈中單個(gè)氨基酸替代突變。hptS突變類型有6類，同樣均引起HptS肽鏈中單個(gè)氨基酸替代突變。hptA突變類型有5類，其中TypeBhptA突變?yōu)閔ptA基因中932號(hào)堿基T刪除，造成HptA肽鏈在第31位提前出現(xiàn)終止密碼子；TypeChptA突變?yōu)閔ptA基因中405號(hào)堿基G突變?yōu)锳，造成原先的189號(hào)密碼子突變?yōu)榻K止密碼子；余hptA基因突變均造成HptA肽鏈中單個(gè)氨基酸替代突變。每種突變類型的名稱、具體的變異位點(diǎn)、突變率及磷霉素MIC見表2。hptR的TypeAhptR型突變，hptS的TypeAhptS、TypeBhptS、TypeChptS突變及hptA的TypeAhptA、TypeBhptA、TypeChptA突變僅在磷霉素耐藥株中出現(xiàn)；而hptR的TypeⅠhptR、TypeⅡhptR突變，hptS的TypeⅠhptS、TypeⅡhptS、TypeⅢhptS型突變及hptA的TypeⅠhptA、TypeⅡhptA型突變?cè)诿舾兄曛幸嘤谐霈F(xiàn)。50株菌中，hptR基因突變多表現(xiàn)為單位點(diǎn)突變，僅1株hptR基因出現(xiàn)TypeⅠhptR+TypeⅡhptR的突變組合。hptS基因多為多位點(diǎn)復(fù)合突變，有16株菌hptS基因出現(xiàn)TypeAhptS+TypeⅠhptS的突變，27株菌hptS基因出現(xiàn)TypeⅠhptS+TypeⅡhptS的組合。有7株菌hptA基因呈現(xiàn)多位點(diǎn)復(fù)合突變，其中5株菌hptA突變類型為TypeⅠhptA+TypeChptA，2株菌為TypeⅠhptA+TypeBhptA。hptRSA三個(gè)基因具體突變類型的組合所對(duì)應(yīng)的菌株數(shù)量及MIC分布范圍見表3。

表2 （續(xù)）Table 2（continued）

2.3 fosB 、glpT 和uhpT基因突變及磷霉素MIC

50株菌中，存在uhpT基因、glpT基因任一突變或fosB基因陽性的菌株共計(jì)31株，僅2株為磷霉素敏感株（MIC為2 mg/L），其余29株對(duì)磷霉素耐藥，MIC分布于128～＞1 024 mg/L。31株菌中，uhpT突變有25株，皆為磷霉素耐藥株，磷霉素MIC分布于128～＞1 024 mg/L；8株fosB基因陰性且glpT基因無突變，均為磷霉素耐藥株，磷霉素MIC分布于128～＞1 024 mg/L。19株fosB基因陰性且glpT和uhpT無突變的菌株，磷霉素MIC分布于1～128 mg/ L，其中5株對(duì)磷霉素耐藥，MIC分布于64～128 mg/L。fosB基因陰性且glpT無突變的菌株共計(jì)27株，磷霉素MIC分布于1～＞1 024 mg/ L。

2.4 hptRSA-uhpT突變類型與磷霉素耐藥相關(guān)性

選取上述fosB基因陰性且glpT無突變的27株菌株，分析uhpT、hptRSA突變情況與磷霉素MIC相關(guān)性。

表3 hptRSA基因突變分布及對(duì)應(yīng)菌株磷霉素MIC范圍Table 3 Distribution of hptRSA gene mutation and fosfomycin minimum inhibitory concentration in MRSA isolates

這些菌株中uhpT突變類型有4類，分別為T904 插入、T27刪除、第1073位堿基G被堿基T替代（G1073T）及第335位堿基G被堿基A替代（G335A）。8株攜帶有uhpT突變的菌株磷霉素MIC分布于128～＞1 024 mg/L。這8株菌中，uhpTT27刪除的菌株有4株，其中有3株菌hptR、hptS及hptA基因均攜帶有各自TypeA型突變，MIC分布于256～512 mg/L，1株不攜帶TypeA突變菌株的MIC為128 mg/L。見表4。

19株fosB基因陰性且glpT和uhpT均無突變的菌株，磷霉素MIC分布于1～128 mg/L。在hptR和hptS基因突變類型分布一致的前提下，hptA基因存在突變的18株菌株中有6株菌的hptA基因突變類型為TypeIhptA+TypeChptA或TypeIhptA+TypeBhptA，磷霉素MIC分布于32～128 mg/L（2株MIC=128 mg/ L，3株MIC=64 mg/L，1株MIC=32 mg/ L），其余12株菌MIC分布于1～32 mg/ L（1株MIC 32 mg/L，1株MIC 16 mg/ L，其余10株MIC分布于1～8 mg/L）。見表4。

表4 fosB基因陰性、glpT基因無突變菌株中hptA基因突變與磷霉素敏感性關(guān)系Table 4 Correlation between hptRSA mutation and fosfomycin susceptibility in fosB(-)，wild-type glpT strains

3 討論

金葡菌磷霉素耐藥機(jī)制主要包括Fos修飾蛋白的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白UhpT和GlpT突變，靶蛋白MurA突變等[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：磷霉素耐藥金葡菌臨床菌株中，磷霉素修飾基因和靶蛋白變異相對(duì)少見，卻存在廣泛的glpT和uhpT基因變異[12]。金葡菌標(biāo)準(zhǔn)株Newman敲除glpT或uhpT基因后，細(xì)菌對(duì)磷霉素耐藥性明顯增強(qiáng)（MIC分別上升8倍和64倍）[7]。有文獻(xiàn)顯示HptRSA蛋白可調(diào)控uhpT基因表達(dá)，繼而影響菌株的磷霉素MIC[9]。近期研究顯示當(dāng)細(xì)胞外存在G-6-P時(shí)，HptA蛋白感知胞外G-6-P，激活HptRS系統(tǒng)，HptR與uhpT上游啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，上調(diào)uhpT基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)磷霉素敏感性升高[14]。本研究聚焦于hptRSA基因突變與磷霉素耐藥之間的相關(guān)性，在臨床無菌體液分離到的MRSA菌株中進(jìn)行篩查，并分析這些突變對(duì)菌株磷霉素耐藥性的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，我院2004－2014年無菌體液臨床分離得到MRSA菌株中，68.0% （34/50）對(duì)磷霉素耐藥。這些菌株中廣泛存在hptRSA基因的突變，hptR的TypeAhptR型突變，hptS的TypeAhptS、TypeBhptS、TypeChptS突變及hptA的TypeAhptA、TypeBhptA、TypeChptA突變僅在磷霉素耐藥株中出現(xiàn)，這幾種突變類型可能與耐藥有關(guān)。有超過半數(shù)（55.9%）的磷霉素耐藥MRSA菌株同時(shí)攜帶TypeAhptR+TypeAhptS+TypeAhptA型突變，且這些菌株對(duì)磷霉素多呈高水平耐藥（MIC在256～＞1 024 mg/L，其中13株磷霉素MIC＞1 024 mg/ L）。同時(shí)，無論是否攜帶fosB基因、是否存在glpT基因突變，所有攜帶uhpT基因突變的菌株均為磷霉素耐藥株，提示uhpT突變?cè)诹酌顾啬退幹衅鸬搅酥匾淖饔谩６趂osB基因陰性、glpT基因無變異、下游uhpT突變類型相同的菌株中，TypeAhptR+TypeAhptS+TypeAhptA型突變類型菌株磷霉素MIC是攜帶其他突變類型的菌株的2～4倍。由此推測(cè)TypeAhptR+TypeAhptS+TypeAhptA型聯(lián)合突變可能在下游基因uhpT存在突變的基礎(chǔ)上進(jìn)一步導(dǎo)致磷霉素MIC升高。

本次研究還發(fā)現(xiàn)，uhpT/glpT存在突變或fosB陽性的菌株中有90.3%（28/31）對(duì)磷霉素耐藥，顯著高于uhpT和glpT無突變且fosB陰性菌株（26.3%，5/19）。而在fosB基因陰性、glpT和uhpT基因均不存在突變的磷霉素耐藥MRSA的菌株中，存在TypeBhptA或TypeChptA型突變株的6株菌MIC分布于32～128 mg/L，顯著高于無上述2種突變的菌株。因此推測(cè)TypeBhptA型和TypeChptA型突變可單獨(dú)介導(dǎo)磷霉素MIC耐藥或臨界耐藥。

綜上所述，HptRSA復(fù)合體的基因突變?cè)谂R床分離磷霉素耐藥MRSA菌株中并不少見；hptR、hptS和hptA三基因常同時(shí)發(fā)生某一特定類型聯(lián)合突變可導(dǎo)致磷霉素高水平耐藥；hptA單基因突變亦可能在MRSA磷霉素耐藥形成中有重要作用。可繼續(xù)行敲除及回補(bǔ)試驗(yàn)，以進(jìn)一步確認(rèn)hptA基因在介導(dǎo)MRSA磷霉素耐藥中的作用。