李春翼，田勇，楊雅軒，李葦舟，趙吉春,2，李富華,2，明建,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶,400715)

多酚化合物是植物細(xì)胞中一種具有苯環(huán)上連接多羥基基團(tuán)結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)稱。由于多酚化合物對人體健康有一定的促進(jìn)作用，特別是在預(yù)防慢性疾病方面具有較好的效果[1]，已成為食品營養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)?？茖W(xué)研究證實(shí)，多酚化合物的多羥基能與蛋白質(zhì)、多糖、生物堿、微生物、金屬等結(jié)合[2-4]。在食品加工和人體消化過程中，多酚化合物能與蛋白質(zhì)大分子發(fā)生相互作用，進(jìn)而影響2類物質(zhì)的功能活性和結(jié)構(gòu)特征。因此，本文綜述了多酚與蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制以及表征方法，以期為多酚/蛋白質(zhì)復(fù)合體系在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 植物多酚與蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制

多酚與蛋白質(zhì)相互作用通過可逆或不可逆的2種方式形成。多酚與蛋白質(zhì)之間可逆相互作用主要是由氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用或范德華力等非共價(jià)作用力形成[5-7]；多酚與蛋白質(zhì)的不可逆相互作用是由共價(jià)鍵作用力形成[8-9]。

1.1 非共價(jià)相互作用機(jī)制

研究證實(shí)，植酸和牛血清白蛋白(Bovine albumin, BSA)相互作用的結(jié)合力主要是靜電[5]。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-LG)與蘆丁(Rutin,R)相互作用主要是氫鍵和疏水相互作用[6]。范德華力和氫鍵在黃芩素與酪氨酶結(jié)合中起到主要作用[7]。多酚與蛋白質(zhì)相互作用的非共價(jià)機(jī)制如圖1所示[10]。

圖1 多酚與蛋白質(zhì)非共價(jià)相互作用機(jī)制[10]Fig.1 Mechanisms of non-covalent interactions between polyphenols and proteins

1.2 共價(jià)相互作用機(jī)制

共價(jià)相互作用是多酚與蛋白質(zhì)相互作用中最重要的方式，因?yàn)樗豢赡娴赜绊?類物質(zhì)的性質(zhì)。PRODPRAN研究發(fā)現(xiàn)多酚與肌原纖維蛋白發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，使游離氨基含量較大程度地降低與肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC)的條帶強(qiáng)度，證實(shí)了多酚對大鯛魚肌原纖維蛋白性質(zhì)產(chǎn)生較大的影響[8]。SUI[9]也證實(shí)了花青素與大豆蛋白之間共價(jià)鍵的存在。目前，普遍認(rèn)為多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)相互作用機(jī)制主要是鄰醌形成機(jī)制：多酚化合物由于其高度反應(yīng)性而易被氧化或自動氧化生成相應(yīng)的鄰醌或半醌，然后進(jìn)一步與蛋白質(zhì)的側(cè)鏈賴氨酸或半胱氨酸殘基等共價(jià)結(jié)合[11]。圖2為多酚與蛋白質(zhì)共價(jià)相互作用機(jī)制示意圖[12]。

圖2 EGCG通過自動氧化與蛋白質(zhì)半胱氨酰巰基結(jié)合的機(jī)制[12]Fig.2 Proposed mechanism for EGCG binding to a protein cysteinyl thiol group through autoxidation

2 植物多酚與蛋白質(zhì)互作機(jī)制的表征方法

由于多酚與蛋白質(zhì)相互作用非常復(fù)雜，解析其作用機(jī)制必須借助光譜、質(zhì)譜、顯微等技術(shù)。通過獲得的特征參數(shù)如特征光譜系數(shù)、結(jié)合常數(shù)、親和力指數(shù)及空間結(jié)構(gòu)變化等[13]，解析多酚與蛋白質(zhì)之間的互作機(jī)制。本文從光譜學(xué)、波譜學(xué)、量熱技術(shù)、結(jié)構(gòu)化學(xué)和其他技術(shù)對植物多酚和蛋白質(zhì)互作機(jī)制表征的方法進(jìn)行了分類闡述。

2.1 光譜學(xué)技術(shù)

2.1.1 熒光光譜法

熒光光譜法廣泛應(yīng)用于多酚與蛋白質(zhì)相互作用的研究中，其中熒光猝滅法是確定多酚與蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合位點(diǎn)數(shù)與結(jié)合常數(shù)的一種簡單適用技術(shù)手段[14]。由于苯丙氨酸(Phe)的量子產(chǎn)率很低，酪氨酸(Tyr)能被電離或在靠近羧基、氨基時(shí)其熒光幾乎全部猝滅[15]。因此，一般利用色氨酸(Trp)為熒光探針來研究蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象以及與小分子/阿魏酸(FA)/表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)之間的相互作用。酪氨酸酶的熒光強(qiáng)度隨著黃芩素的添加而減弱，猝滅類型為靜態(tài)和動態(tài)猝滅[7]。3種多酚對β-LG熒光強(qiáng)度的淬滅能力為EGCG>綠原酸(CGA)>FA[15]。

2.1.2 傅里葉變換紅外光譜法(fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)

蛋白質(zhì)酰胺帶的紅外光譜可提供其二級結(jié)構(gòu)信息，特征吸收帶主要有酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶，因酰胺I區(qū)域信號強(qiáng)而被廣泛使用[17]。酰胺I帶能給出蛋白質(zhì)的α-螺旋(1 650～1 658 cm-1)、β-折疊(1 610～1 640 cm-1)、β-轉(zhuǎn)角(1 660～1 695 cm-1)和無規(guī)卷曲(1 640～1 650 cm-1)等多種結(jié)構(gòu)信息[18]，其紅外吸收峰的變化反映了蛋白質(zhì)特定二級結(jié)構(gòu)的變化。SUI研究認(rèn)為大豆蛋白與花青素復(fù)合后[9]，β-折疊含量顯著下降，而β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量顯著增加，表明β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。ZOU研究認(rèn)為玉米醇溶蛋白(zein)與單寧(T)復(fù)合后[19]，使蛋白在1 657 cm-1處的吸收峰與T在1 614 cm-1處的吸收峰發(fā)生了重疊，并且在3 356 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰。

2.1.3 拉曼光譜法

拉曼光譜[20]因其具有簡單、快速、可靠的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于食品的分析檢測中，其本質(zhì)上屬于分子光譜，拉曼譜線的長度、數(shù)目和位移大小與樣品分子的振動和轉(zhuǎn)動相關(guān)，因此拉曼光譜可獲得分子的振動和轉(zhuǎn)動信息，為物質(zhì)鑒定及結(jié)構(gòu)研究(如紅外光譜)提供補(bǔ)充信息。LIU研究發(fā)現(xiàn)表面活性劑鼠李糖脂和復(fù)合物的拉曼光譜均觀察不到較明顯的峰[21]，而姜黃素(curcumin, Cur)在1 625，1 599，1 428，1 316和1 248 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)峰，白藜蘆醇在1 628，1 602，1 348，1 303，1 261，1 207，1 154，995 cm-1處有峰出現(xiàn)，這可能是由多酚濃度減少或者多酚與周圍基質(zhì)的相互作用引起的。XU等研究發(fā)現(xiàn)三價(jià)鐵(5 μmol/L)的添加使絲蛋白(silk fibroin, SF)酰胺I帶的峰值由1 660 cm-1變?yōu)? 670 cm-1[22]。當(dāng)EGCG存在時(shí)，SF酰胺I帶的峰值不受三價(jià)鐵的影響，維持在1 660 cm-1處。

2.1.4 圓二色譜(circular dichroism, CD)

圓二色性是由左右圓偏振光吸附的差異引起的，在測量時(shí)，波長的函數(shù)為二色性時(shí)即可得到圓二光譜，蛋白質(zhì)的遠(yuǎn)、近紫外CD譜可分別用于觀測蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)變化[23-24]。β-LG與多酚結(jié)合后其二級結(jié)構(gòu)由α螺旋向β結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，伴隨著β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的輕微增加[16]。GUO等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)黃芩素與酪氨酸酶的摩爾比為4∶1時(shí)[7]，α-螺旋的含量下降了3.67%，β-鏈的含量增加了3.33%，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)線圈則無明顯變化。

上述4種表征方法的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用見表1。

2.2 波譜學(xué)技術(shù)

2.2.1 核磁共振光譜法(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)

NMR通過檢測分子結(jié)構(gòu)中標(biāo)記的碳元素的化學(xué)位移，直接表明多酚與蛋白質(zhì)是否發(fā)生結(jié)合作用或間接表明相關(guān)構(gòu)象的改變[27]。多酚-蛋白質(zhì)相互作用的所有結(jié)合位點(diǎn)都與特定NMR峰相關(guān)，13C-NMR為蛋白質(zhì)配體之間競爭位點(diǎn)特異性分析研究的有力工具，NMR可精確識別結(jié)合位點(diǎn)信息，解釋相互作用機(jī)理，分析相互作用構(gòu)效關(guān)系，但也存在著檢測靈敏度較低、需樣量大、易受溶劑影響、對樣品濃度和穩(wěn)定性要求較高、圖譜解析復(fù)雜等問題[28]。DELIUS[29]研究發(fā)現(xiàn)EGCG和表兒茶素-3-沒食子酸酯(ECG)的半最大結(jié)合常數(shù)BC50分別為0.2和0.3 μmol/L，與唾液黏蛋白的結(jié)合力最強(qiáng)，其余4種多酚與黏液蛋白的結(jié)合力大小為：表沒食子兒茶素(EGC)>表兒茶素(EC)>沒食子酸甲酯(EG)>R。

表1 多酚與蛋白質(zhì)相互作用常見表征方法的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用Table 1 Advantages, disadvantages and applications of common characterization methods of interaction between polyphenols and proteins

2.2.2 表面等離子共振(surface plasmon resonance, SPR)

SPR的原理是根據(jù)表面等離子體與消逝波發(fā)生共振，表面介質(zhì)折射率不同會引起共振波長、共振峰位置以及共振角的不同，從而實(shí)現(xiàn)待測物的檢測。SPR測定能夠提供分子間相互作用的親和常數(shù)和反應(yīng)動力學(xué)，以及分子溶液中的活性濃度，且SPR具有高選擇性，實(shí)時(shí)檢測，需樣量少，不需標(biāo)記反應(yīng)物，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但商業(yè)化的儀器成本較高，檢測極限較高，吞吐量較低[30-31]。其工作原理如圖3所示[32]。

PARK等[33]使用SPR研究了從構(gòu)樹中提取的多酚化合物與冠狀病毒蛋白酶動力學(xué)結(jié)合參數(shù)，結(jié)果表明木犀草素A顯著地增加了SPR傳感，且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

圖3 SPR儀器的原理(左)和典型的SPR傳感圖(右)[32]Fig.3 The principle of SPR instrument (left) and typical SPR sensorgram showing the steps of an analytical cycle (right)

2.3 量熱技術(shù)

2.3.1 等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry, ITC)

ITC主要用于檢測多酚與蛋白質(zhì)相互作用過程中的熱力學(xué)變化，可得到如親和力、熵、焓、比熱容以及化學(xué)計(jì)量學(xué)的信息，ITC可以直接和定量測量多酚與蛋白質(zhì)之間的相互作用及其對多酚/蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響[23]。其靈敏度高、重復(fù)性好，為在線無損檢測，可一次性測定所有結(jié)合參數(shù)，不受沉淀影響，但加熱效應(yīng)弱、測試耗時(shí)、需樣量大，難以確定大粒徑蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)[34]。KASPCHAK等[5]探討了加熱和不同離子強(qiáng)度條件下BSA與植酸、T的相互作用，發(fā)現(xiàn)植酸與BSA相互作用主要受靜電力支配，隨著離子強(qiáng)度的增加，兩者的結(jié)合下降，而溫度表現(xiàn)出相反的效果；T與BSA的結(jié)合隨著溫度的增加而增加，離子強(qiáng)度的下降而增加。

2.3.2 差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)

熱分析被廣泛用于聚合物的表征,當(dāng)體系放熱、吸熱或者熱容量發(fā)生改變時(shí)，DSC能獲得涉及到的物理化學(xué)變化定性或定量信息，獲得動力學(xué)數(shù)據(jù)。DSC分析具有靈敏度高，操作簡單快速，適用性廣，樣品使用量少、無需前處理等優(yōu)點(diǎn)，但也存在著成本高，當(dāng)樣品量少、材料不均勻時(shí)不能很好代表整體[35]等問題。SUN等[36]分別從3種茶(綠茶、黑茶和烏龍茶)中提取多酚，并將其加入到豬胰α-淀粉酶(PPA)中，DSC結(jié)果表明，3種茶多酚的加入使PPA的ΔH和變性溫度降低，且隨著茶多酚濃度的提高，PPA的熱穩(wěn)定性下降。對于8種多酚標(biāo)品，T、ECG、EGCG和茶黃素-3,3’-二乙醇酸鹽能使PPA的ΔH和變性溫度變小，而茶黃素、茶黃素3’-沒食子酸酯、EGC和EC對PPA的ΔH和變性溫度無明顯影響。

2.4 結(jié)構(gòu)解析技術(shù)

2.4.1 原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)

AFM是在掃描隧道顯微鏡基礎(chǔ)上研制而成的一種掃描探針顯微鏡，通過探針與被測樣品之間的微相互作用(原子力)獲得物質(zhì)超微結(jié)構(gòu)及表面信息，進(jìn)而對樣品表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。AFM不僅可以測定物質(zhì)在原子或分子水平上的表面特征，而且可以測定極微弱的相互作用(皮克牛頓/pN級)，研究分子間的相互作用，常用于表征多酚與蛋白質(zhì)的相互作用。AFM能提供三維表面圖，樣品制備簡單、無需覆蓋導(dǎo)電薄膜，成像和力分辨率高，但成像范圍小、速度慢、受探頭影響較大[37-38]。SUN等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cur加入到zein與蟲膠的復(fù)合顆粒中時(shí)[39]，在復(fù)合顆粒的AFM圖像中觀察到明顯不同的形態(tài)，三元體系表現(xiàn)出一種含多個(gè)直徑范圍(0.64～1.89 μm)的微球網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表明Cur摻入形成了形狀不規(guī)則的大尺寸聚集體。

2.4.2 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)

目前SEM分辨力為6～10 nm，通過電子束射到樣品表面產(chǎn)生次級電子，次級電子富集后轉(zhuǎn)變成電信號,從而得到表面結(jié)構(gòu)的立體掃描圖像、微觀形貌放大像、表面組成分布、晶體的晶向和晶格常數(shù)、發(fā)光性試樣的結(jié)構(gòu)缺陷等。在進(jìn)行SEM觀察時(shí)樣品制備容易，耗時(shí)少，并可做綜合分析，放大倍數(shù)范圍廣，場深大。但SEM的分辨率有限[40-41]。T與BSA的復(fù)合物是具有良好組織結(jié)構(gòu)的大團(tuán)聚體，經(jīng)煮沸后呈現(xiàn)無孔隙穿孔的結(jié)構(gòu)；而植酸-BSA復(fù)合物組織結(jié)構(gòu)較差，呈現(xiàn)不均勻、脆的形態(tài)[5]。

2.4.3 激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscopy, LSCM)

LSCM[42]是一門20世紀(jì)末發(fā)展起來并逐漸得到廣泛應(yīng)用的技術(shù)，可對固定的組織或活體樣本進(jìn)行亞細(xì)胞水平結(jié)構(gòu)分析。相較于常規(guī)的光學(xué)顯微鏡，LSCM的主要特點(diǎn)是通過共焦光學(xué)消除不需要的焦點(diǎn)外散射光，增強(qiáng)樣品的焦點(diǎn)內(nèi)區(qū)域的對比度。CLSM具有較高精度，能夠3D成像，噪聲比得到改進(jìn)，且對試樣無特殊要求，通過光散射減少圖像模糊性，缺點(diǎn)是分辨率較SEM低，成本高[43-44]。ZOU等研究發(fā)現(xiàn)，在zein-單寧復(fù)合顆粒制備的乳液中能夠觀察到油滴周圍的界面蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)[19]。

2.5 其他技術(shù)

2.5.1 分子對接

分子對接[45]是一種通過計(jì)算，從而實(shí)現(xiàn)模擬分子間相互識別的方法，可確定配體與靶結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合構(gòu)象和最佳位置、方向。剛性對接速度快，柔性對接構(gòu)象可轉(zhuǎn)換，但難以選擇正確的結(jié)合位點(diǎn)，對接軟件的準(zhǔn)確性不夠，匹配算法和評分方案較難確定，且剛性對接缺乏實(shí)際應(yīng)用，柔性對接耗時(shí)較長，需計(jì)算吞吐量[46]。R與β-LG有2個(gè)最可能的結(jié)合位點(diǎn)，位點(diǎn)1位于β-LG的內(nèi)腔，主要作用力為疏水相互作用；位點(diǎn)2則位于邊緣，具體示意圖如圖4所示[6]。LI等[47]為深入探討4種黃酮類化合物(芹菜素、柚皮苷、山奈素和金雀異黃素)與β-LG的相互作用，發(fā)現(xiàn)β-LG與疏水配體有3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因位點(diǎn)2生成的構(gòu)象最穩(wěn)定且能量最高，因此位點(diǎn)2被認(rèn)為是β-LG與配體結(jié)合的最適位點(diǎn)。

A-利用SiteMap預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)1和2；B-位點(diǎn)2的曲面表示；C-位點(diǎn)1的曲面表示[6]圖4 R與β-LG的分子對接Fig.4 Molecular docking of rutin with β-LG

2.5.2 分子動態(tài)(molecular dynamics, MD)模擬

分子動態(tài)模擬[48]能在原子水平上獲取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，且具有瞬時(shí)清晰度，能夠得到構(gòu)象變化、配體結(jié)合以及蛋白質(zhì)折疊的信息。此外，分子動態(tài)模擬還可在原子水平上預(yù)測干擾(突變、磷酸化、質(zhì)子化或配體的添加或去除)對生物分子的影響。缺點(diǎn)是識別最相關(guān)、最重要的信息具有挑戰(zhàn)性，在模擬過程中共價(jià)鍵不會形成和斷裂，因此應(yīng)小心設(shè)置[49]。AL-SHABIB等研究R與β-LG互作的動力學(xué)性質(zhì)[6]，發(fā)現(xiàn)配體的均方根偏差(root mean square distance, RSMD)和旋轉(zhuǎn)半徑均表現(xiàn)為初始階段的數(shù)據(jù)波動，最后達(dá)到穩(wěn)定。可能是由于R進(jìn)入β-LG的疏水腔引起了相應(yīng)的數(shù)據(jù)起伏，當(dāng)穩(wěn)定的復(fù)合物形成時(shí),數(shù)據(jù)則達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。R與β-LG中的Glu62、Asp85和Asn90形成氫鍵，與Leu39、Val41和Ile84形成疏水相互作用。ZHANG等[50]研究7種黃酮類化合物(白楊素、山奈素、非瑟酮、高良姜素、染料木黃酮、槲皮素和芹菜素)與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6/細(xì)胞周期D(CDK6/cyclin D)形成的復(fù)合物系統(tǒng)的穩(wěn)定性時(shí)，發(fā)現(xiàn)前6種多酚的RSMD均小于0.35 nm，即適用于MD模擬分析，其中非瑟酮、槲皮素以及三奈素的RSMD(小于0.05 nm)波動均小于其他多酚。此外，芹菜素與蛋白形成的氫鍵數(shù)量高于其他多酚。3’,4’,7-三羥基黃酮(M15)與CDK6/cyclin D的MD模擬圖如圖5所示[50]。

圖5 (a)M15的化學(xué)結(jié)構(gòu)；(b)M15-CDK6/cyclin D復(fù)合物的RMSD分布；(c)M15-CDK6/cyclin D相互作用圖；(d)MD模擬期間氫鍵的數(shù)目[50]Fig.5 (a)Chemical structure of M15; (b)RMSD profile of M15-CDK6/cyclin D complex; (c)M15-CDK6/cyclin D interaction plot;(d)The number of hydrogen bonds during the MD simulation

3 展望

由于多酚對人體健康具有良好的促進(jìn)作用，且與蛋白質(zhì)大分子具有高度親和力。深入研究多酚與蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制可以有助于改進(jìn)富含蛋白質(zhì)與酚類化合物的食品生產(chǎn)工藝條件和參數(shù)，提升產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值。鑒于目前研究多酚與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)手段各有優(yōu)勢，因此需將多種表征方法綜合應(yīng)用，例如，常采用熒光光譜法、紫外可見光譜和FT-IR等方法聯(lián)合表征多酚與蛋白質(zhì)相互作用，獲得不同的物理化學(xué)參數(shù)，從不同角度解析多酚與蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制。與此同時(shí)，深入研究多酚與蛋白質(zhì)相互作用還需要?jiǎng)?chuàng)新應(yīng)用新的檢測方法與技術(shù)，如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)，更好地獲得關(guān)于蛋白質(zhì)與酚類化合物相互作用的詳細(xì)信息。隨著蛋白組學(xué)技術(shù)(蛋白質(zhì)制備、分離、鑒定和相互作用等技術(shù))的不斷完善，必定會頻繁地應(yīng)用在多酚-蛋白質(zhì)相互作用的研究中；同時(shí)，傳統(tǒng)蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)與光譜技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用也具有較大的應(yīng)用前景。