李偉麗，伍姚，劉玉淑，喻卉，任艷嬌，周文化，吳韜*

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都，610039)2(中南林業(yè)科技大學(xué) 特醫(yī)食品加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙，410004)

血紅素是由二價(jià)鐵離子鑲嵌在原卟啉中而構(gòu)成的鐵卟啉類化合物，可作為血紅蛋白、肌紅蛋白等的輔基成分，主要存在于動(dòng)物的血液和肌肉中，具有改善貧血、降低肺動(dòng)脈高壓等作用，在保健食品、醫(yī)藥等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用[1-3]。氯化血紅素(又名血晶素、氯化高鐵血紅素)是一種由4個(gè)吡咯環(huán)組成的，含有共軛結(jié)構(gòu)的生物鐵化合物[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，氯化血紅素是一種吸收效果好、無毒副作用的缺鐵性貧血的食品原料及色素添加劑，也可作為過氧化物模擬酶、生物態(tài)鐵劑等，具有廣闊的應(yīng)用前景[6-9]。

氯化血紅素的檢測方法已有較多報(bào)道，包括紫外分光光度法[10]、高效液相色譜法[11]和流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法[12]等。其中，紫外分光光度法、高效液相色譜法是在特定波長下利用氯化血紅素紫外吸收能力進(jìn)行的定量分析，如果樣品中存在不易分離的雜質(zhì)干擾，可能會(huì)影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法靈敏度不高，分析時(shí)間較長，無法適用于食品中更精確、更微量的分析。超高效液相串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-QTOF-MS)同時(shí)具有高效的色譜分離和m/z高分辨率的優(yōu)點(diǎn)，可以同時(shí)對(duì)食品等復(fù)雜體系中的目標(biāo)成分進(jìn)行快速地定性、定量分析[13-17]。目前尚未見到利用UHPLC-QTOF-MS測定氯化血紅素的含量研究。本文擬研究建立UHPLC-QTOF-MS方法進(jìn)行氯化血紅素的定性定量分析，根據(jù)氯化血紅素的精確分子量和二級(jí)碎片離子進(jìn)行準(zhǔn)確定量，排除了其他雜質(zhì)的干擾，能夠?yàn)槁然t素的測定提供有效理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀，日本島津儀器有限公司；X500飛行時(shí)間質(zhì)譜，上海愛博才思分析儀器有限公司；BT-25S分析天平，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；SB-5200DTN超聲清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

NaOH(分析純)、氯化血紅素標(biāo)品，上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；氯化血紅素保健品樣品(編號(hào)為1、2、3、4號(hào))，四川某制藥有限公司；甲醇(色譜純)，Sigma公司，實(shí)驗(yàn)用水均是超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜分析條件

色譜柱：采用C18柱(1.8 μm粒徑，2.0 mm i.d×75 mm)；流動(dòng)相：A相，純甲醇溶液；B相，0.02%甲酸-水溶液(體積分?jǐn)?shù))；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL，色譜柱溫度：40℃；采用梯度洗脫，流速保持不變，初始B相為80%，0～2 min，B相60%；2～4 min，B相50%；4～6 min，A相100%，保持2 min；8～9 min，B相80%，保持1 min。

1.2.2 質(zhì)譜分析條件

離子源：ESI離子源；掃描方式：MRM正離子模式。質(zhì)譜分析條件：氣簾氣(CUR)35psi，離子化壓力(IS)5500 V，溫度(TEM)300℃，噴霧氣(GS1)45 psi，輔助加熱氣(GS2)55 psi，去簇電壓(DP)80 V，碰撞能量(CE)15 V，掃描范圍m/z100～1 000。

1.2.3 前處理方法

氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：稱取0.1 mg氯化血紅素標(biāo)品溶解于1.0 mL 0.10 mol/L NaOH溶液，將標(biāo)品原液貯存于-18 ℃?zhèn)溆?。用甲醇將?biāo)品原液分別稀釋成質(zhì)量濃度2.5、12.5、25.0、50.0、100.0 mg/L。

食品原料樣品準(zhǔn)備：分別稱取50.0 mg樣品溶解在1.0 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中，超聲提取15 min后，過0.22 μm有機(jī)濾膜，吸取濾液1.0 mL，用甲醇稀釋100倍。將稀釋液貯存于-18 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 方法驗(yàn)證

通過測量加標(biāo)回收率、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限(limit of detection, LOD)[18]、定量限(limit of quantity, LOQ)、日內(nèi)精密度來驗(yàn)證方法的可靠性。本實(shí)驗(yàn)選擇具有較高氯化血紅素含量的3號(hào)樣品進(jìn)行方法驗(yàn)證。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法測定氯化血紅素LOD和LOQ，以定量離子信噪比(S/N)3倍所對(duì)應(yīng)目標(biāo)物的濃度作為LOD，S/N的10倍作為LOQ。通過分析25、50和100 mg/mL 3種加標(biāo)濃度來確定加標(biāo)回收率，樣品與加標(biāo)量的體積比為1∶1，并用公式(1)計(jì)算加標(biāo)回收率[19]。

(1)

式中：Csm是加標(biāo)測量值;Cm是樣品的測量值;Cs是加標(biāo)前標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。

通過用樣品溶液溶解并稀釋標(biāo)品來制備基質(zhì)效應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，校準(zhǔn)曲線2.50～100.00 mg/L?；|(zhì)效應(yīng)通過公式(2)計(jì)算[20-22]。

(2)

式中：a是基質(zhì)校準(zhǔn)曲線的斜率;b是溶劑校準(zhǔn)曲線的斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)品的定性研究

從氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的一級(jí)質(zhì)譜圖看出(圖1-A)，一級(jí)質(zhì)譜的最強(qiáng)離子峰為m/z616，沒有發(fā)現(xiàn)分子離子峰m/z651。其可能原因在于氯化血紅素中氯原子的共價(jià)鍵能力較弱，容易在ESI離子化過程中失去，因此選定m/z616 進(jìn)行二級(jí)碎裂。如圖1-B所示，二級(jí)離子碎片主要為557.160 2和498.148 1。氯化血紅素分子離子的斷裂特點(diǎn)為母環(huán)不發(fā)生碎裂，只在側(cè)基CH2CH2COOH發(fā)生中性丟失反應(yīng)。當(dāng)血紅素分子離子丟失1個(gè)CH2COOH時(shí)，得到m/z557的碎片離子，而丟失2個(gè)CH2COOH時(shí)則得到m/z498的碎片離子。為了降低氯化血紅素鐵的檢出限，選擇信號(hào)最強(qiáng)的離子對(duì)(616.173 2→557.160 2)，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)作對(duì)氯化血紅素進(jìn)行定量分析。氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)品在MRM掃描模式下的色譜圖見圖1-C，經(jīng)過色譜優(yōu)化以后，在6.5 min左右實(shí)現(xiàn)分離且峰型良好。

圖1 氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)品氯化血紅素標(biāo)品一級(jí)質(zhì)譜圖(A)，氯化血紅素標(biāo)品二級(jí)質(zhì)譜圖(B)，氯化血紅素標(biāo)品色譜圖(C)Fig.1 Figures of hemin standard mass spectrum of hemin standard(A), MS/MS spectrum of hemin standard(B),chromat-ogram of hemin standard(C)

2.2 血紅素保健品中氯化血紅素定性定量分析

圖2-A是1號(hào)保健品的一級(jí)質(zhì)譜圖，其最強(qiáng)峰為m/z616。對(duì)m/z616進(jìn)行二級(jí)碎裂，其二級(jí)質(zhì)譜圖(圖2-B)和氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)品二級(jí)質(zhì)譜完全一致，因此確定血紅素保健品含有氯化血紅素。在MRM掃描模式下的提取的色譜圖如圖2-C所示，該樣品峰型較好。其可能原因是采用MRM檢測模式，排除了雜質(zhì)干擾。

圖2 氯化血紅素樣品圖(1號(hào)樣品)氯化血紅素樣品一級(jí)質(zhì)譜圖(A)，氯化血紅素樣品二級(jí)質(zhì)譜圖(B)，氯化血紅素樣品色譜圖(C)Fig.2 Hemin sample (sample No. 1) mass spectrum of hemin sample(A), MS/MS spectrum of hemin sample(B),chroma-togram of hemin sample(C)

按照本實(shí)驗(yàn)所建立的方法，對(duì)4份樣品中的氯化血紅素進(jìn)行定性定量分析，檢測結(jié)果見表1。由表1可知，在4種樣品中均檢測出氯化血紅素，其中4號(hào)樣品的氯化血紅素含量最高為7.40%，2號(hào)樣品的含量最低為1.16%，1、3號(hào)樣品的含量分別為1.40%、7.32%。

表1 樣品中氯化血紅素的含量分析(n=3)Table 1 Analysis of the content of hemin in the sample

2.3 方法的線性范圍，檢出限、定量限和精密度

在設(shè)定的UHPLC-QTOF-MS條件下，將氯化血紅素的質(zhì)量濃度(mg/L)作為橫坐標(biāo)x，氯化血紅素的峰面積作為縱坐標(biāo)y進(jìn)行線性回歸，確定回歸方程為y=130 110.294 2x+1 402 020，其相關(guān)系數(shù)(R2)為0.957，線性2.50～100.0 mg/L。由表2可知，氯化血紅素的檢出限和定量限分別為1.25 μg/L和4.00 μg/L，與高效液相色譜法測得檢出限和定量限分別為0.11 mg/L和0.37 mg/L相比[23]，UHPLC-QTOF-MS方法的檢出限和定量限分別降低了88倍和92倍。這表明UHPLC-QTOF-MS方法對(duì)于測定氯化血紅素具有更高的靈敏度。根據(jù)SANTE/ 11945/2015歐盟指南[24]，≤20%表明取得較好的精密度。實(shí)驗(yàn)測得RSD為3.84%，表明該方法具有較好的精密度，能夠準(zhǔn)確可靠的對(duì)氯化血紅素進(jìn)行定量分析。

2.4 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，本研究選取3號(hào)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。分別向3號(hào)樣品中分別加入25、50、100 mg/L不同質(zhì)量濃度的氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)品，混勻，測定其回收率。每個(gè)加標(biāo)樣品重復(fù)測定6次，其結(jié)果見表3。

表2 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回歸方程、檢出限、定量限和精密度Table 2 Linear regression equations, correlation coefficient, LOD, LOQ and precision

表3 加標(biāo)回收率(n=6)Table 3 Spiked recoveries rate(n=6)

由表3可知，3號(hào)樣品分別添加3個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品測得的回收率分別為80.65%、91.06%、102.99%，這表明該實(shí)驗(yàn)方法具有較高的回收率。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)通常表明樣品其他成分對(duì)被測組分的影響?；|(zhì)在電離過程中會(huì)對(duì)目標(biāo)物的電離產(chǎn)生增強(qiáng)或者抑制作用，這可能會(huì)對(duì)復(fù)雜樣品的定量分析產(chǎn)生不利影響。根據(jù)研究表明[25]，|基質(zhì)效應(yīng)|≥50%被認(rèn)為具有強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。由表4可知，氯化血紅素的基質(zhì)效應(yīng)<50%，表明基質(zhì)對(duì)氯化血紅素的定量分析影響相對(duì)較弱。

表4 基質(zhì)效應(yīng)與校準(zhǔn)曲線Table 4 Matrix effect and calibration curve

3 結(jié)論

本文首次建立了UHPLC-QTOF-MS快速測定氯化血紅素的分析方法，該方法通過目標(biāo)物分子量和二級(jí)碎片離子進(jìn)行定量分析。在ESI+電離模式的條件下，氯化血紅素在6.5 min左右達(dá)到最佳分離效果，檢測限和定量限分別為1.25 μg/L和4.00 μg/L，回收率范圍為80.65%～102.99%，精密度為3.84%。此方法的優(yōu)勢在于樣品前處理簡單，能夠有效為保健品中氯化血紅素的定性定量測定提供理論依據(jù)。