艾文婷，姜雪，張敏, 2, 3, 4*，邵婷婷，劉威，趙昱瑄，郝爽，厲建國

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)3(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海，201306)4(食品科學(xué)與工程國家級試驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海，201306)

黃瓜原名胡瓜，又名剌瓜、青瓜，是葫蘆科一年生草本蔓生攀緣植物。黃瓜營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，其富含蛋白質(zhì)、糖類、維生素、胡蘿卜素、尼克酸及鈣、磷、鐵、鉀等礦物質(zhì)，長期食用可抗腫瘤、防衰老、防酒精中毒、降血糖、減肥強(qiáng)體。但黃瓜采后不易貯藏，是典型的冷敏易腐型果蔬，在普通冷藏環(huán)境或不適宜的低溫條件下極易發(fā)生冷害[1]。冷敏感型果蔬的冷害機(jī)理與控制研究一直是采后生理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。貯藏在低溫逆境下的果蔬，隨著冷害發(fā)生，表現(xiàn)出各種癥狀，主要為表皮凹陷、失去顏色、內(nèi)外果皮有水漬狀斑點(diǎn)、果皮發(fā)生木質(zhì)化和褐化、組織有裂縫等[2]。而且，冷害發(fā)生的表現(xiàn)與癥狀表現(xiàn)不同步，恢復(fù)到常溫條件后的果蔬比正常情況下腐爛得更快，即冷害隱蔽現(xiàn)象。果蔬冷害的發(fā)生，會導(dǎo)致膜脂由正常狀態(tài)下的流動(dòng)液態(tài)鑲嵌相轉(zhuǎn)變?yōu)榫w固態(tài)相，細(xì)胞膜收縮，膜上出現(xiàn)龜裂和孔道，膜透性增強(qiáng)[3]，膜內(nèi)大量可溶性物質(zhì)及電解質(zhì)等向膜外滲透，滲出的離子濃度增大，細(xì)胞膜組織的電解質(zhì)滲透率升高[4-5]。而膜滲透率越大說明受到的冷害越重，因此電解質(zhì)外滲率能夠作為評價(jià)果蔬受到冷害程度的指標(biāo)，且比觀察冷害癥狀更為可靠。通過變溫處理[6-7]、貯前熱處理[8-13]等方法可以減輕冷敏型果蔬的冷害癥狀。而作為果蔬采后簡單物理處理方法之一的熱處理技術(shù)，對減輕長時(shí)間低溫冷藏造成的果蔬傷害、改善果蔬品質(zhì)、延長其貯藏期等具有一定的效果[14-15]。吳光斌等[16]在研究枇杷冷害中發(fā)現(xiàn)，將枇杷果實(shí)熱激處理后貯于2 ℃～5 ℃的環(huán)境中能夠緩解由低溫引起的呼吸速率異常升高癥狀，推遲冷害癥狀的出現(xiàn)時(shí)間，增強(qiáng)細(xì)胞膜的抗冷性，冷害程度明顯減輕。喬勇進(jìn)等[17]也發(fā)現(xiàn)，熱水處理可以減輕由低溫造成的膜傷害，維持膜的穩(wěn)定性，延緩黃瓜細(xì)胞膜滲透率的增加，延緩和抑制冷害的發(fā)生?，F(xiàn)今熱處理對冷敏型果蔬的影響研究已經(jīng)較為成熟，但關(guān)于熱激處理中達(dá)到最佳效果的具體熱激溫度及熱激時(shí)間的研究卻并不常見。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上，對熱水處理減輕黃瓜冷害的最佳熱激溫度及熱激時(shí)間進(jìn)行了研究。

本研究采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方法，能夠有效快速地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件[18-19]，是一種應(yīng)用較為廣泛的試驗(yàn)優(yōu)化方法，曾有多位學(xué)者將其用于提取工藝或配方的優(yōu)化[20-22]，但該試驗(yàn)方法用于果蔬冷害防治優(yōu)化的研究還鮮見報(bào)道。本研究采用電解質(zhì)外滲率作為黃瓜冷害程度指標(biāo)值進(jìn)行試驗(yàn)的優(yōu)化，采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，以熱激溫度、熱激時(shí)間及貯藏時(shí)間作為水平變量，優(yōu)化黃瓜的最佳熱激處理?xiàng)l件，以期為黃瓜冷害的防治提供一定的試驗(yàn)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為“申青”黃瓜，購于上海市臨港新城大棚種植園。果實(shí)完全成熟，長度約(30±2) cm，直徑約(3.5±0.5) cm，單個(gè)果實(shí)的質(zhì)量約為(200±20) g，果實(shí)飽滿無明顯機(jī)械損傷。將運(yùn)回試驗(yàn)室的黃瓜樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)臎_洗，分別于不同溫度(30～62 ℃)熱水中熱激一定時(shí)間(0～80 min)后，拭干，裝入厚約0.01 mm的聚乙烯薄膜包裝袋中，每袋3根，保持間距，在冷庫中(4 ℃，85%RH)貯藏0～12 d后用于黃瓜果實(shí)在低溫條件下電解質(zhì)外滲率的試驗(yàn)研究。每個(gè)處理組黃瓜30根，重復(fù)試驗(yàn)。

1.2 測定方法

1.2.1 電解質(zhì)滲透率的測定

參考解越等[23]電導(dǎo)率測定方法并作修改。使用切片器從黃瓜樣品中間部位切下3片厚度約為0.7 mm的均勻薄片，切取時(shí)應(yīng)保證薄片厚度大小均勻一致并且盡量減少損傷。再使用打孔器從每片黃瓜薄片果肉部分打取面積約為0.25 cm2的5片組織圓片，分別放入已標(biāo)記的燒杯中，依次加入20 mL去離子水，使樣品完全浸沒。將裝有樣品的燒杯置入轉(zhuǎn)速150 r/min、25 ℃的振蕩箱內(nèi)振蕩10 min，待去離子水完全浸透樣品，用紗布過濾掉燒杯中的水，然后加入20 mL去離子水沖洗，如此反復(fù)3次，用濾紙吸干殘留在組織圓片表面中的水分，再次放入對應(yīng)的燒杯中，加入20 mL去離子水，通過電導(dǎo)率測試儀測定樣品的初始電導(dǎo)率(R0)。然后將燒杯放入真空干燥器中，連接真空泵與真空表后進(jìn)行抽氣，壓力控制在0.06～0.08 MPa，滲透時(shí)間30 min。之后將燒杯取出，使用保鮮膜和橡皮筋對燒杯進(jìn)行封口后，再放入上述條件振蕩箱內(nèi)振蕩1 h。待振蕩結(jié)束，取出燒杯，置于室溫條件下(20±2 ℃)靜置，測定樣品活體組織提取液的電導(dǎo)值(R)。最后用保鮮膜封口，于沸水中煮沸10 min后，再次冷卻至室溫，測定組織被完全殺死后的提取液的電導(dǎo)值(R′)。用公式(1)計(jì)算電解質(zhì)外滲百分率(Y)。

(1)

式中：R，所測樣品活體組織提取液的電導(dǎo)值，μS/cm；R′，組織被完全殺死后提取液的電導(dǎo)值，μS/cm；R0，初始電導(dǎo)值，μS/cm。

1.2.2 冷害指數(shù)

將黃瓜樣品在室溫條件下(20±2 ℃)放置2 d后，測定其冷害指數(shù)。參考MARTNEZ-TéLLEZ M[24]的方法，根據(jù)癥狀將冷害現(xiàn)象分為5個(gè)等級：①0級，無冷害現(xiàn)象發(fā)生；②1級，冷害面積<1/4；③2級，冷害面積約為1/4～1/2；④3級，冷害面積約為1/2～3/4 ；⑤4級，冷害面積>3/4[25]。用公式(2)計(jì)算冷害指數(shù)。

(2)

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對熱激溫度、熱激時(shí)間、貯藏時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測定電解質(zhì)外滲率，每個(gè)處理組含30根黃瓜樣品，取平均值。再以單因素試驗(yàn)確定各因素水平范圍，利用三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化得到減輕黃瓜冷害的最佳熱激處理?xiàng)l件。如表1所示，以熱激溫度、熱激時(shí)間和貯藏時(shí)間為試驗(yàn)因素，對試驗(yàn)因素水平編碼[27]。以電解質(zhì)外滲百分率Y作為指標(biāo)值，進(jìn)行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)。將黃瓜按照表1中熱激時(shí)間及熱激溫度用熱水進(jìn)行熱激處理，隨后將熱激后的黃瓜置于冷庫(4 ℃，RH85%)中貯藏，按時(shí)取樣，測定黃瓜指標(biāo)值。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factor level code table

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SAS 9.1.3處理系統(tǒng)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并繪制等高線圖和響應(yīng)面圖，采用Excel 2003進(jìn)行折線圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 熱激溫度單因素試驗(yàn)分析

在前期黃瓜熱激的預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)熱激溫度達(dá)到70 ℃以上時(shí)，黃瓜出現(xiàn)失水、皺縮變黃等現(xiàn)象，因此在熱激溫度單因素試驗(yàn)中，從30～62 ℃范圍內(nèi)選取了30、38、46、54、62 ℃的熱水，然后分別熱激30 min，處理后于4 ℃下貯藏5 d(第5天所有處理方式均發(fā)生不同程度的冷害現(xiàn)象)，測定黃瓜樣品的電解質(zhì)外滲率。雖然冷害指數(shù)能夠較為直觀地表現(xiàn)出黃瓜果實(shí)受低溫脅迫傷害程度，但其有一定的滯后性，因此，同時(shí)觀察在室溫下放置2 d后的黃瓜樣品的冷害指數(shù)，與電解質(zhì)外滲率指標(biāo)值的趨勢進(jìn)行比較。

如圖1所示，30、38、46、54、62 ℃的熱激處理下的黃瓜果實(shí)組織的電解質(zhì)外滲率分別為(22.54±0.19)%，(18.42±0.12)%，(26.34±0.25)%，(28.32±0.17)%，(33.68±0.20)%。結(jié)果表明，黃瓜果實(shí)低溫逆境脅迫下的電解質(zhì)外滲率的變化與熱激溫度有顯著關(guān)系(P<0.05)。電解質(zhì)外滲率隨著溫度的升高先迅速降低后快速升高至緩慢增長，即受冷害程度隨熱激溫度先降低后升高。當(dāng)用38 ℃熱激處理時(shí)，電解質(zhì)外滲率最低。表2為不同熱激溫度對黃瓜冷害指數(shù)的影響。結(jié)果表明，黃瓜冷害指數(shù)變化也呈相似的變化趨勢，即隨著溫度的升高冷害指數(shù)先降低后升高，最后趨于平緩。由圖1可知，黃瓜樣品經(jīng)38 ℃熱激處理后，受低溫傷害最小，與電解質(zhì)外滲率的變化趨勢一致。

圖1 熱激溫度單因素試驗(yàn)Fig.1 Single factor experiment of heat shock temperature

表2 不同熱激溫度對黃瓜冷害指數(shù)的影響Table 2 Chilling injury index of cucumber under different heat shock temperatures

注：表中數(shù)據(jù)為各組樣品“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n=30)；不同字母表示差異性顯著(P<0.05)。下同。

2.1.2 熱激時(shí)間單因素試驗(yàn)分析

在38 ℃熱水中分別熱激黃瓜樣品0、20、40、60、80 min，然后于4 ℃下貯藏5 d，測定其電解質(zhì)外滲率。并觀察計(jì)算在室溫下放置2 d后的黃瓜樣品的冷害指數(shù)，與電解質(zhì)外滲率指標(biāo)值的變化趨勢進(jìn)行比較。

如圖2所示，當(dāng)在38 ℃環(huán)境下熱處理0、20、40、60、80 min后，黃瓜果實(shí)組織的電解質(zhì)外滲率分別為(27.31±0.21)%，(19.42±0.23)%，(22.54±0.17)%，(23.65±0.26)%，(29.46±0.12)%。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，黃瓜果實(shí)低溫逆境脅迫下的電解質(zhì)外滲率變化與熱激時(shí)間有顯著關(guān)系(P<0.05)。電解質(zhì)外滲率隨熱激時(shí)間的增加先迅速降低后緩慢上升，即隨熱激時(shí)間的增加受冷害程度先下降后上升。當(dāng)熱激時(shí)間為20 min時(shí)，電解質(zhì)外滲率達(dá)到最低。

表3為不同熱激時(shí)間對黃瓜冷害指數(shù)的影響。結(jié)果表明，黃瓜冷害指數(shù)變化呈相似的變化趨勢，即先下降后上升。如圖2所示，黃瓜樣品在20 min熱激處理下，受低溫逆境傷害最小，與電解質(zhì)外滲率的變化趨勢一致。

圖2 熱激時(shí)間單因素試驗(yàn)Fig.2 Single factor experiment of heat shock time

表3 不同熱激時(shí)間對黃瓜冷害指數(shù)的影響Table 3 Chilling injury index of cucumber under different heat shock time

2.1.3 貯藏時(shí)間單因素試驗(yàn)分析

在38 ℃熱水中熱激黃瓜樣品30 min后，將樣品放置在4 ℃下分別貯藏0、3、6、9、12 d，分別測定其電解質(zhì)外滲率。并觀察在室溫下放置2 d后的黃瓜樣品的冷害指數(shù)，與電解質(zhì)外滲率指標(biāo)值的趨勢進(jìn)行比較。

如圖3所示，將在38 ℃環(huán)境下熱激處理20 min后的黃瓜果實(shí)組織放置在4℃下，貯藏0、3、6、9、12 d，其電解質(zhì)外滲率分別為(17.40±0.18)%，(24.29±0.16)%，(27.32±0.12)%，(29.34±0.24)%，(33.91±0.27)%。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，黃瓜果實(shí)低溫逆境脅迫下的電解質(zhì)外滲率變化與貯藏時(shí)間有顯著關(guān)系(P<0.05)。電解質(zhì)外滲率隨著貯藏時(shí)間的增加持續(xù)升高，即隨貯藏時(shí)間的延長受冷害程度呈一直上升的趨勢。在整個(gè)周期中，電解質(zhì)外滲率增長了94.89%。表4為不同貯藏時(shí)間對黃瓜冷害指數(shù)的影響。結(jié)果表明，黃瓜冷害指數(shù)變化呈相似的變化趨勢，即冷害指數(shù)隨著貯藏時(shí)間的延長，呈現(xiàn)上升趨勢。這表明隨著貯藏時(shí)間的增加，黃瓜樣品受低溫逆境傷害程度逐漸增大，與電解質(zhì)外滲率的變化趨勢一致。這也進(jìn)一步驗(yàn)證了電解質(zhì)外滲率作為評價(jià)冷害程度指標(biāo)的可靠性。

圖3 貯藏時(shí)間單因素試驗(yàn)Fig.3 Single factor experiment of storage time

貯藏天數(shù)/d036912冷害指數(shù)0a0a0.03±0.000 6b0.07±0.000 5c0.28±0.000 4d

2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以使電解質(zhì)外滲率達(dá)到最低的處理?xiàng)l件為中心選取一定范圍作為二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平。根據(jù)上述結(jié)果選取30～50 ℃的熱激濕度，0～60 min的熱激時(shí)間，選取貯藏時(shí)間為0～10 d。采用3因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方法，以電解質(zhì)外滲百分率Y為指標(biāo)值，進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。貯藏期間，黃瓜果肉組織電解質(zhì)外滲率的試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Quadratic regression orthogonal rotating combination design and experimental results

注:X1-熱激溫度，℃；X2-熱激時(shí)間，min;X3-貯藏時(shí)間，d。

經(jīng)過SAS 9.1.3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[28]，將所得數(shù)據(jù)采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行擬合。表6～表7為回歸方程的方差分析、各項(xiàng)的方差分析和參數(shù)估計(jì)及顯著性分析[24]。

表6 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 6 Variance analysis of the test

2.3 電解質(zhì)外滲率數(shù)學(xué)回歸模型

表7 試驗(yàn)二次回歸模型參數(shù)Table 7 Regression model parameters

根據(jù)表6所列方差分析，對回歸方程進(jìn)行失擬項(xiàng)檢驗(yàn)：F1F0.01(9，13)=4.19極顯著，P<0.001，說明回歸模型與實(shí)測值能較好的擬和，模型成立。

在σ=0.10顯著水平剔除不顯著項(xiàng)，得到的回歸方程為：

根據(jù)回歸方程繪制貯藏時(shí)間5 d，熱激溫度x1、熱激時(shí)間x2和貯藏時(shí)間x3對電解質(zhì)外滲率Y影響的等高線圖和響應(yīng)面曲線圖(圖4)。

圖4 指標(biāo)值Y的等高線圖(a)與響應(yīng)曲面圖(b)Fig.4 Contour plots(a) and response surface plots(b) of index value Y2

通過擬合分析，以電解質(zhì)外滲率Y表征的黃瓜冷害指標(biāo)，在熱激溫度由30 ～50 ℃，熱激時(shí)間0～60 min時(shí)達(dá)到最小值23.92%，優(yōu)化處理結(jié)果為熱激溫度37.5 ℃、熱激時(shí)間24 min。按照最佳熱激處理?xiàng)l件對優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，選取30根黃瓜樣品進(jìn)行熱激處理，在第5天時(shí)測定電解質(zhì)外滲率實(shí)測值為Y=25.13%，與理論值Y=23.92%較為接近，進(jìn)一步驗(yàn)證了數(shù)學(xué)回歸模型。而根據(jù)單因素試驗(yàn)2.1.1的結(jié)果，38 ℃熱水處理30 min，于4 ℃冷庫中貯藏5 d再于室溫放置2 d后的冷害指數(shù)最低為0.03，驗(yàn)證試驗(yàn)于第5天時(shí)再置于室溫2 d后的冷害指數(shù)也為0.03，與實(shí)際試驗(yàn)值一致，此實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到了減輕采后黃瓜冷害較佳的熱水處理組合。

3 結(jié)論與討論

熱激溫度、熱激時(shí)間及貯藏時(shí)間的單因素試驗(yàn)表明，在熱激溫度30～62 ℃范圍內(nèi)熱激30 min并于4 ℃下貯藏5 d，電解質(zhì)外滲率隨溫度的升高先降低后升高；在38 ℃熱水中熱激0～80 min并于4 ℃下貯藏5 d，電解質(zhì)外滲率隨熱激時(shí)間的增加先降低后上升；在38 ℃熱水中熱激30 min并于4 ℃下貯藏0～12 d，指標(biāo)值電解質(zhì)外滲率隨著貯藏時(shí)間的增加持續(xù)升高。即在30～62 ℃熱激溫度和0～80 min熱激時(shí)間范圍內(nèi)，在其他條件不變的情況下，隨著熱激溫度或熱激時(shí)間的增加，黃瓜受害程度先降低后升高；隨貯藏時(shí)間的增加，黃瓜受害程度持續(xù)升高。這一現(xiàn)象與前人[17,31-33]對熱激黃瓜的研究結(jié)果相吻合。

根據(jù)三因素二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果表明通過最佳的熱水處理后，黃瓜在第5天的電解質(zhì)外滲率計(jì)算值為23.92%，實(shí)測值為25.13%，在4 ℃冷庫中貯藏5 d，再于室溫下放置2 d后的冷害指數(shù)為0.03，這一結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于MAO等[34]和NASEF等[35]所測黃瓜的冷害指數(shù)和電解質(zhì)外滲率。從而驗(yàn)證了該模型試驗(yàn)結(jié)果較好，能夠改善黃瓜的貯藏品質(zhì)與冷害現(xiàn)象。

適宜的熱激處理能對低溫貯藏下的供試黃瓜的貯藏品質(zhì)起到改善作用，并對冷害防治起到較好效果。但是熱激處理對冷害防治的機(jī)理研究尚不明確，仍應(yīng)從DNA、RNA以及蛋白質(zhì)代謝、采后果蔬衰老機(jī)制及激素平衡等多方面進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。