楊立娜，吳凱為，徐清瑩，王如意，曲歌，吳昊桐，朱力杰，馬濤*

1(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州，121013)2(生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州，121013)3(遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州，121013)

荔枝草是一種來自民間的傳統(tǒng)小型中草藥，屬于唇形科植物[1]。廣泛分布于亞洲和大洋洲，尤其是在中國(guó)和印度的濕地中[2]。藥理學(xué)研究表明，荔枝草具有抗炎活性、抗病毒、保肝等活性作用，其粉末具有很強(qiáng)的抗氧化活性[3-6]，這和荔枝草中含有的茶多酚、氨基酸、茶色素、茶多糖有密切的關(guān)系。荔枝草一直以來被用于治療咳嗽、肝炎和腹瀉等炎癥疾病[7]，從荔枝草中可以分離出很多天然產(chǎn)品，包括黃酮類、木脂素類、二萜類化合物、倍半萜類化合物等,它們都具有廣泛的生物活性[8]。

冠突散囊菌是茯磚茶生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的優(yōu)勢(shì)菌種，具有降脂、抗氧化和抗腫瘤等生理活性[9-10]。在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種酶類，可以分解利用茶葉中的大分子物質(zhì)，使活性成分發(fā)生復(fù)雜的變化，通過“發(fā)花”這道獨(dú)特的工序改善茯磚茶原有品質(zhì)[11-12]。茶葉香氣作為評(píng)價(jià)茶葉好壞的一個(gè)重要指標(biāo)，直接影響著茶葉的品質(zhì)以及消費(fèi)者的認(rèn)可程度，在發(fā)酵過程中，冠突散囊菌產(chǎn)生特有的香氣物質(zhì)，能有效地改善荔枝草發(fā)酵茶的感官品質(zhì)[13]，研究中使用電子鼻和電子舌進(jìn)行發(fā)酵前后荔枝草發(fā)酵茶的風(fēng)味變化差異分析。本實(shí)驗(yàn)采用冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵荔枝草的方法，對(duì)荔枝草發(fā)酵過程中主要活性成分及風(fēng)味的變化進(jìn)行研究，為進(jìn)一步探討荔枝草茶品質(zhì)形成機(jī)理并改善其品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝草原葉采購(gòu)于市場(chǎng)；冠突散囊菌分離于大紅袍茶，經(jīng)多代單菌落純化培養(yǎng)并測(cè)序鑒定，保藏在4 ℃冰箱待用。

Na2CO3、NaHCO3、Na2HPO4、KH2PO4、草酸、葡萄糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、醋酸乙酯、95%乙醇、正丁醇、茚三酮、氯化亞錫、谷氨酸、蒽酮，天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；福林酚，沒食子酸，北京索萊寶科技有限公司；濃H2SO4，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

改良查氏液體培養(yǎng)基[14]：NaNO33 g/L，K2HPO41 g/L, MgSO40.5 g/L, NaCl 50 g/L,蔗糖40 g/L，用蒸餾水充分?jǐn)嚢枋垢鞒煞秩芙猓铀ㄈ葜? L，121 ℃高溫滅菌20 min，待用。以上各試劑均為分析純，購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)科技試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-D型臺(tái)式恒溫振蕩器，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；LRH-150型生化培養(yǎng)箱、DHG-9055A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD型紫外潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZF-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；AR124CN型電子天平，沈陽杰龍儀器有限公司；DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TDL-5-A型低速臺(tái)式大型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；PEN3型便攜式電子鼻，德國(guó)Airsense公司；SA402B型電子舌，日本INSENT公司。

1.3 方法

1.3.1 冠突散囊菌孢子懸液的制備

將實(shí)驗(yàn)室保藏的冠突散囊菌菌種復(fù)蘇，復(fù)壯，用接種環(huán)將菌刮下，在滅菌后的250 mL液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)7 d，制備成濃度為1.0×107CFU/mL孢子懸液。

1.3.2 發(fā)酵茶的制備工藝

將處理好的荔枝草茶葉15 g置于250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min[15]，放置20 min晾至室溫。加入一定量的冠突散囊菌孢子懸液，使茶葉充分濕潤(rùn)，并在28 ℃的環(huán)境中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵7 d后取出，在80 ℃烘箱內(nèi)干燥2 h，制得成茶。具體技術(shù)流程如下：

鮮葉采摘→蒸煮殺青→揉捻→烘干→復(fù)水→滅菌→接種發(fā)酵→烘干→成茶

1.3.3 主要成分的測(cè)定

茶多酚的測(cè)定：參考GB/T 8313—2008茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測(cè)方法；氨基酸的測(cè)定：參考GB/T 8314—2013茶游離氨基酸總量的測(cè)定；茶色素的測(cè)定：系統(tǒng)分析法[16]；可溶性糖的測(cè)定：蒽酮-硫酸法[17]。

1.3.4 荔枝草茶發(fā)酵前后氣味的電子鼻檢測(cè)

荔枝草茶樣品前處理方法：準(zhǔn)確稱取5.0 g(精確到0.01g)茶葉樣品于150 mL錐形瓶中，倒入100 mL事先煮沸的蒸餾水進(jìn)行沖泡，使用封口膜將瓶口密封浸泡10 min后，取漏斗快速過濾得到澄清茶液，取10 mL澄清茶液于20 mL頂空瓶中，加入3.0 g NaCl，水浴鍋中70℃預(yù)熱25 min，每個(gè)茶樣做5個(gè)平行[18]。

電子鼻分析條件：測(cè)定時(shí)間為120 s，清洗時(shí)間110 s，樣品間隔1 s，傳感器室流量350 mL/min，測(cè)量樣品流量350 mL/min。PEN3型便捷式電子鼻傳感器性能描述見表1[19]。

1.3.5 荔枝草茶發(fā)酵前后氣味的電子舌檢測(cè)

荔枝草茶樣品前處理方法：準(zhǔn)確稱取5.0 g(精確到0.01 g)茶葉樣品于250 mL錐形瓶中，倒入250 mL事先煮沸的蒸餾水進(jìn)行沖泡，使用封口膜將瓶口密封浸泡10 min，8層紗布過濾，濾液裝瓶密封，冷卻至室溫待測(cè)用[20]。電子舌分析條件：清洗時(shí)間5.5 min，傳感器自檢時(shí)間30 s，樣品測(cè)試時(shí)間30 s，測(cè)量回味30 s。SA402B型便捷式電子舌傳感器性能描述見表2。

表1 PEN3型便捷式電子鼻傳感器性能描述Table 1 Properties of sensor on PEN3 electronic nose

表2 SA402B型便捷式電子舌傳感器性能描述Table 2 Properties of sensor on SA402B electronic tongue

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過軟件SPSS19.0進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)處理,每組試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)取平均值，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，作圖利用OriginPro8.6與Excel2010進(jìn)行處理，電子鼻的數(shù)據(jù)分析采用主成分分析和Loading分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵階段茶多酚含量的變化

由圖1可以看出，發(fā)酵前和發(fā)酵第2天茶多酚含量變化不顯著，隨后茶多酚含量呈下降趨勢(shì)且變化顯著，在發(fā)酵過程中，茶多酚含量由發(fā)酵前32.69%下降至22.27%，降幅為31.88%。有研究表明，茶葉的加工方式對(duì)茶葉中茶多酚含量有較大的影響，含量大小依次為：未發(fā)酵茶>微發(fā)酵茶>半發(fā)酵茶>全發(fā)酵茶[21]，因此荔枝草發(fā)酵茶中由于冠突散囊菌代謝旺盛，使得發(fā)酵后的荔枝草茶茶多酚含量明顯降低，此外，在發(fā)酵過程中冠突散囊菌產(chǎn)生多種胞外酶，在多酚氧化酶的作用下，茶葉中的多酚類物質(zhì)被氧化成醌類[22]，使茶多酚含量下降，由此減少了荔枝草發(fā)酵茶的苦澀味。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間荔枝草茶中茶多酚含量變化Fig.1 Variations of tea polyphenols in Salvia plebeia tea during the different fermentation time

2.2 不同發(fā)酵階段氨基酸含量的變化

由圖2可以看出，氨基酸含量呈顯著下降趨勢(shì)，發(fā)酵前期下降趨勢(shì)不明顯，隨時(shí)發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，氨基酸含量逐漸降低，由發(fā)酵前的4.79%下降至3.05%，降幅為36.3%。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間荔枝草茶中氨基酸含量變化Fig.2 Variations of amino acid in Salvia plebeia tea during the different fermentation time

發(fā)酵過程中，氨基酸含量持續(xù)下降可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中，氨基酸為微生物提供生長(zhǎng)所需的碳源或氮源被部分消耗，并且隨著荔枝草茶的發(fā)酵，氨基酸進(jìn)一步發(fā)生脫羧和氧化脫氨生成醛類物質(zhì)以及水解、縮合等反應(yīng)，形成荔枝草發(fā)酵茶的香氣物質(zhì)[23]，由此證明冠突散囊菌發(fā)酵荔枝草茶可以改善荔枝草茶本身的澀味，進(jìn)一步提高其感官品質(zhì)。

2.3 不同發(fā)酵階段茶色素含量的變化

由圖3-a和圖3-b可以看出，在發(fā)酵過程中茶黃素和茶紅素有著較為接近的變化趨勢(shì)，即在發(fā)酵第6天前，色素累計(jì)含量逐漸升高且增長(zhǎng)越來越迅速，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，增長(zhǎng)趨勢(shì)開始減緩，這是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中，冠突散囊菌發(fā)酵產(chǎn)生的多酚氧化酶將茶多酚主要物質(zhì)兒茶素氧化為醌類，再進(jìn)一步縮聚形成茶黃素和茶紅素，因此發(fā)酵前期這2種色素增長(zhǎng)較快[24]。由圖3-c可以看出，茶褐素的變化隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)不斷增加，且有加快的趨勢(shì)，這是因?yàn)榘l(fā)酵過程中茶黃素和茶紅素發(fā)生氧化聚合反應(yīng)生成茶褐素，使得茶褐素的含量不斷增多，與此同時(shí)茶黃素和茶紅素的增長(zhǎng)速度減緩[25]。在整個(gè)發(fā)酵過程中，3種茶色素含量有不同程度的提高，茶黃素增長(zhǎng)3.02倍，茶紅素增長(zhǎng)1.73倍，茶褐素增長(zhǎng)1.29倍，這種變化也有效地改善了荔枝草發(fā)酵茶茶湯的感官品質(zhì)。

a-茶黃素含量；b-茶紅素含量；c-茶褐素含量圖3 不同發(fā)酵時(shí)間荔枝草茶中茶色素含量變化Fig.3 Variations of tea pigments contents in Salvia plebeia tea during the different fermentation time

2.4 不同發(fā)酵階段可溶性糖含量的變化

由圖4可以看出，在發(fā)酵過程中可溶性糖含量呈減少的趨勢(shì)，尤其在發(fā)酵前2 d，降幅最為明顯，此后下降趨勢(shì)減緩，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，茶葉中可溶性糖含量由1.47%下降至1.1%，降幅達(dá)到25.17%。在發(fā)酵過程中冠突散囊菌產(chǎn)生多種胞外酶，包括纖維素酶和果膠酶，這些胞外酶將茶葉中的多糖分解為單糖，促進(jìn)可溶性糖的溶出，為微生物的生長(zhǎng)提供所需碳源[26]。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間荔枝草茶中可溶性糖含量變化Fig.4 Variations of soluble sugar in Salvia plebeia tea during the different fermentation time

2.5 電子鼻分析荔枝草茶發(fā)酵前后風(fēng)味的差異

圖5為未發(fā)酵、冠突散囊菌發(fā)酵荔枝草茶的主成分分析，對(duì)同一樣品進(jìn)行多次取樣判斷檢測(cè)穩(wěn)定性。其主成分1(PC1，90.64%)和主成分2(PC2，5.95%)的總貢獻(xiàn)率為96.59%，>90%，說明PC1和PC2包含很大的信息量，能夠反應(yīng)所有性狀指標(biāo)所提供的信息。從圖5可以看出，未發(fā)酵和發(fā)酵的荔枝草茶分布于不同的區(qū)域，說明電子鼻能良好地區(qū)分2種樣品。

圖5 荔枝草茶發(fā)酵前后的PCA分析Fig.5 PCA analysis of Salvia plebeia tea before and after fermentation

圖6為電子鼻10個(gè)傳感器分別對(duì)樣品的PCA主成分分析的貢獻(xiàn)率。R(2)傳感器對(duì)第1主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率最大，是第1主成分的特征信號(hào)；R(9)傳感器對(duì)第2主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率最大。根據(jù)各傳感器對(duì)不同物質(zhì)的特異敏感度，說明氮氧化合物在荔枝草發(fā)酵茶中的貢獻(xiàn)率最大，而有機(jī)硫化物在茶葉香氣成分第2主成分中貢獻(xiàn)率最大。

圖6 荔枝草茶發(fā)酵前后Loading分析Fig.6 Loading analysis of Salvia plebeia tea before and after fermentation

2.6 電子舌分析荔枝草茶發(fā)酵前后風(fēng)味的差異

本實(shí)驗(yàn)使用的電子舌設(shè)備含有5個(gè)檢測(cè)探頭，分別為酸味(CAO)、苦味(COO)、澀味(AEI)、鮮味(AAE)、咸味(CTO)，通過檢測(cè)后得到酸味、苦味、澀味、鮮味、咸味、苦味回味、澀味回味、豐富度8組滋味指標(biāo)[37]。由圖7可以看出，5個(gè)滋味傳感器對(duì)發(fā)酵前后2種茶葉均有響應(yīng)，但敏感度略有差異，苦味、澀味、咸味傳感器響應(yīng)值較為明顯，鮮味和酸味傳感器響應(yīng)值較低。發(fā)酵后代表茶葉感官的苦味和澀味響應(yīng)值降低，這表明通過冠突散囊菌的發(fā)酵改善了荔枝草發(fā)酵茶的感官品質(zhì)。

圖7 荔枝草茶發(fā)酵前后茶湯滋味雷達(dá)圖Fig.7 Radar plot of Salvia plebeia tea flavor before and after fermentation

3 結(jié)論

對(duì)冠突散囊菌發(fā)酵的荔枝草發(fā)酵茶不同階段的主要成分及風(fēng)味變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在荔枝草發(fā)酵過程中，茶多酚、氨基酸和可溶性糖含量變化規(guī)律相似，呈現(xiàn)隨發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸降低的趨勢(shì)；茶黃素和茶紅素的變化規(guī)律相似，增長(zhǎng)速率先增加后減緩，而茶褐素含量隨發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸升高；在風(fēng)味檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后苦味、澀味明顯降低，本實(shí)驗(yàn)表明冠突散囊菌的生長(zhǎng)使得茶葉中主要理化成分及風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生了顯著地變化，有效地改善了荔枝草發(fā)酵茶的品質(zhì)，為今后荔枝草發(fā)酵茶的進(jìn)一步生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。