肖嵐，何佩云，謝巧，杜昕，李誠(chéng)*

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014) 2(四川旅游學(xué)院 食品學(xué)院，四川 成都，610100)

通過酶解聯(lián)合發(fā)酵制備的肽粗提液的成分復(fù)雜，要實(shí)現(xiàn)有效的分離純化相對(duì)困難。目前，生物活性肽分離純化的主要手段包括超濾[1-2]、凝膠層析[3-4]、離子交換層析[5]、色譜[6-8]等，為實(shí)現(xiàn)純化目的，普遍采用多種分離手段聯(lián)用的方式。本研究的前期實(shí)驗(yàn)以體外抗氧化指標(biāo)作為評(píng)價(jià)體系，采用枯草芽孢桿菌(SICC1.197)聯(lián)合堿性蛋白酶制備出牦牛血抗氧化低聚肽，利用超濾離心將牦牛血低聚肽分離為分子量>10 kDa、5～10 kDa、<5 kDa三個(gè)組分，利用Sephadex G-25凝膠層析法對(duì)分子量<5 kDa的組分進(jìn)一步分離得到4個(gè)組分，其中組分Ⅰ的·OH清除能力最高，IC50值為0.72 mg/mL[9]。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定組分Ⅰ的分子量分布發(fā)現(xiàn)其肽段主要分布在分子量<1 kDa范圍內(nèi)，而超濾擁有無相變、能耗低、節(jié)約試劑、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，并且能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)化分離并能縮短生產(chǎn)周期[10-12]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用<1 kDa超濾離心代替凝膠層析制備牦牛血抗氧化低聚肽，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行研究，以期獲得更簡(jiǎn)便有效的牦牛血抗氧化低聚肽制備工藝。

缺氧對(duì)機(jī)體是一種緊張性刺激，影響機(jī)體各種代謝，特別是影響機(jī)體的氧化供能，最終會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的心、腦等主要器官缺氧供能不足而死亡[13]。生物體在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中已形成了一套從環(huán)境中有效獲取氧的能力，然而機(jī)體對(duì)缺氧的適應(yīng)能力是有限的，特別是嚴(yán)重缺氧以及急性嚴(yán)重缺氧時(shí)，機(jī)體往往來不及發(fā)揮適應(yīng)機(jī)制便進(jìn)入代謝障礙階段。因此采用一些抗缺氧保健食品(藥物)來改善機(jī)體抗缺氧能力是非常重要的。牦牛是散布在海拔3 000 m以上的特殊家畜，經(jīng)過世代的自然選擇，牦牛顯示出對(duì)低氧環(huán)境極好的適應(yīng)性，這可能與牦牛血液的特殊性有一定關(guān)系[14-16]。姚星辰等[17]報(bào)道牦?；钚缘鞍拙哂酗@著的延長(zhǎng)抗缺氧時(shí)間的作用；李冬利等[18]報(bào)道黃牛血活性肽能顯著延長(zhǎng)小鼠在常壓缺氧和特異性心肌缺氧條件下的存活時(shí)間。實(shí)驗(yàn)組前期研究已證實(shí)，牦牛血低聚肽具有較好的抗氧化活性，而關(guān)于其新的適應(yīng)癥——抗缺氧活性的相關(guān)報(bào)道在國(guó)內(nèi)外比較鮮見。因此，本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)牦牛血抗氧化低聚肽的抗缺氧活性進(jìn)行初探，為進(jìn)一步開發(fā)利用牦牛血低聚肽奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛血，四川省大渡河食品有限公司；蛋白酶K，德國(guó)MERCK公司；堿性蛋白酶(酶活力為85.61 U/mg)，上海Kayon公司；枯草芽孢桿菌SICC1.197，四川省微生物資源平臺(tái)菌種保藏中心；大豆低聚肽(分子量<1 kDa)，西安百川生物科技有限公司，樣品外觀為淺黃色粉末，蛋白質(zhì)含量84.17%，其氨基酸組分見表1；紅景天膠囊(國(guó)食健字G20100243，規(guī)格為 400 mg/粒，每100 g含紅景天苷0.5 g)，北京同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 大豆低聚肽的氨基酸含量Table 1 Amino acid content of soybean oligopeptides

1.2 儀器與設(shè)備

超濾管(<5 kDa)，德國(guó)Sartorius公司；超濾管(<1 kDa),美國(guó)Pall公司；H2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；QYC-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV Power紫外可見分光光度計(jì),北京萊伯泰科儀器有限公司；移液槍,德國(guó)Brand公司；LGJ-50F冷凍干燥機(jī),北京松源華興科技發(fā)展有限公司；A300自動(dòng)氨基酸分析儀,德國(guó)曼默博爾公司；Mission血紅蛋白分析儀,艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛血抗氧化低聚肽的制備及指標(biāo)測(cè)定

1.3.1.1 培養(yǎng)基的配制與菌液制備

將枯草芽孢桿菌于活化培養(yǎng)基活化后，接種于種子培養(yǎng)基，35 ℃、135 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，得到實(shí)驗(yàn)用菌液(1×109/mL)，培養(yǎng)基配制參數(shù)如表2。

表2 培養(yǎng)基的配制 單位：g/L

1.3.1.2 菌酶聯(lián)合制備牦牛血抗氧化低聚肽

采用實(shí)驗(yàn)組前期研究的菌酶聯(lián)合法[19-20]制備牦牛血抗氧化低聚肽。

將1.3.1.1制備的菌液以接種量2.5%(V/V)加入底物質(zhì)量濃度為75 g/L的高壓滅菌(121 ℃，15 min)的牦牛血液中，經(jīng)35 ℃、135 r/min、72 h恒溫振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)高壓滅菌(121 ℃，15 min)，得到牦牛血發(fā)酵液。牦牛血發(fā)酵液冷卻后加入堿性蛋白酶，在酶底比190 U/g、pH 9.5、60 ℃、3 h的條件下進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后經(jīng)沸水水浴滅酶活10 min，得到牦牛血酶解液。將牦牛血酶解液在4 ℃條件下，6 000 r/min離心15 min，取上清液用0.45 μm濾膜抽濾去除菌體殘?jiān)?，再將濾液用5 kDa超濾管于4 ℃條件下，4 000 r/min離心10 min后取上清液得到分子量<5 kDa牦牛血低聚肽；肽液用1 kDa超濾管于4 ℃條件下，4 000 r/min離心30 min后得到分子量 <1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽。

1.3.1.3 分子量分布的測(cè)定

樣品經(jīng)0.2 mol/L NaNO3溶液稀釋后，過0.22 μm濾膜、超聲波脫氣15 min后定容，采用ELEOS System凝膠色譜儀，設(shè)定流速0.5 mL/min、柱溫20 ℃，運(yùn)行ARTRAV軟件后過膜上機(jī)，取基線、定峰后分析可得GPC分子質(zhì)量分布圖。

1.3.1.4 氨基酸組分的分析

采用A300自動(dòng)氨基酸分析儀分析得氨基酸組分分析譜圖。

1.3.2 牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的分析

1.3.2.1 體外抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

·OH清除率測(cè)定參照TIAN F等[21]的方法、抑制脂質(zhì)過氧化能力參照CHEN NAIFU等[22]方法、還原力測(cè)定參照劉昭明等[23]的方法、ABTS+·清除率測(cè)定參照潘瑤等[24]的方法、DPPH·清除率測(cè)定參照朱夕波等[25]的方法、總抗氧化力測(cè)定參照YANG M等[26]的方法。半抑制濃度( IC50) 值的測(cè)定參考杜昕等[19-20]的方法。

1.3.2.2 牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的驗(yàn)證

采用蒸餾水代替牦牛血，其他步驟同 1.3.1.2，制備發(fā)酵液、酶解液以及<1 kDa低聚肽，分別測(cè)定其·OH清除率。按照 1.3.1.1 的方法制備枯草芽孢桿菌菌液；按照酶底比190 U/g將堿性蛋白酶溶解在蒸餾水中；將75 g牦牛血液溶解在1 L蒸餾水，分別測(cè)定其·OH清除率。

1.3.2.3 蛋白酶K驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

分別將分子量<1 kDa 的牦牛血抗氧化肽凍干粉以及分子量<5 kDa的牦牛血抗氧化肽凍干粉配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，加入質(zhì)量濃度100 μg/mL的蛋白酶K溶液，混勻后置于55 ℃下恒溫水浴2 h后，測(cè)定其·OH清除率，以探討牦牛血抗氧化低聚肽的肽段所發(fā)揮的抗氧化活性。

1.3.3 牦牛血抗氧化低聚肽耐缺氧活性的初探

SPF級(jí)KM小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào): SCXK(川)2015-030。將小鼠隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組(等體積的生理鹽水)、紅景天陽性藥物組以及牦牛血低聚肽低、中、高劑量組(365、700、1 500 mg/kg )。灌胃30 d，1 次/d，自由攝食和飲水，灌胃后觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)、覓食量等指標(biāo)。

根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范(2003版)》中“功能學(xué)評(píng)價(jià)程序與檢驗(yàn)方法”進(jìn)行常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)。受試樣品組與對(duì)照組比較，存活時(shí)間延長(zhǎng)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

小鼠Hb含量測(cè)定：自每只小鼠眼眶內(nèi)眥靜脈叢采血，采用Mission 血紅蛋白分析儀檢測(cè)全血Hb含量。按Mission血紅蛋白分析儀說明書進(jìn)行操作。

隨著電氣企業(yè)不斷加強(qiáng)對(duì)電氣自動(dòng)化技術(shù)的優(yōu)化升級(jí)，促使電氣自動(dòng)化控制設(shè)備越來越被廣泛應(yīng)用。當(dāng)前大部分設(shè)備元器件生產(chǎn)企業(yè)在實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中，由于缺乏嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)制度，并且這部分生產(chǎn)企業(yè)規(guī)模相對(duì)較小，在技術(shù)方面、生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)方面等嚴(yán)重不足，導(dǎo)致其生產(chǎn)出來的元器件價(jià)格相對(duì)較低。但是，這部分廠家所生產(chǎn)出來的元件質(zhì)量方面沒有達(dá)標(biāo)，不符合相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，如果將該部分不合格的元件投入實(shí)際的生產(chǎn)當(dāng)中，則必然會(huì)給電氣自動(dòng)化設(shè)備造成嚴(yán)重的影響，并且對(duì)操作人員的人身安全造成威脅。

紅景天用量參照人用量(每日2次，每次3粒)進(jìn)行換算，用蒸餾水溶解紅景天顆粒，配成質(zhì)量濃度36.4 mg/mL的灌胃液，按10 mL/kg BW灌胃；對(duì)照組以蒸餾水灌胃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)3次平行試驗(yàn)后得到，通過方差分析(ANOVA)來檢測(cè)數(shù)據(jù)之間的差異性。統(tǒng)計(jì)分析使用Excel 2013、SPSS 16.0、Origin 8.1等軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子量分布

本實(shí)驗(yàn)對(duì)峰Ⅰ組分進(jìn)行分子量分布的檢測(cè)，結(jié)果如圖1和表3所示， 78.97%的肽段分布在<1 kDa的分子量段，這與文獻(xiàn)報(bào)道的絕大部分具有生理活性的肽段分子質(zhì)量較小[27-29]相吻合。為了簡(jiǎn)化牦牛血抗氧化低聚肽的制備工藝、方便大量制備，本實(shí)驗(yàn)采用超濾分級(jí)的方法制備分子量<1 kDa的牦牛血抗氧化低聚肽。

表3 組分Ⅰ的分子量分布Table 3 Molecular weight distribution of one component

2.2 牦牛血抗氧化低聚肽的氨基酸組成

對(duì)超濾分級(jí)得到的分子量<1 kDa的牦牛血抗氧化低聚肽進(jìn)行氨基酸組分分析，結(jié)果見表4。分子量<1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽的氨基酸組成較為豐富，由13種氨基酸構(gòu)成，氨基酸含量為85.25 g/100g。研究表明，大部分抗氧化肽在N端包含疏水性氨基酸如Val或Leu，并且序列中含有Pro、His[30]、Tyr、Trp[31]和Cys[32]等氨基酸。牦牛血抗氧化低聚肽的抗氧化活性可能與高含量的Leu、Pro以及Tyr有關(guān)。當(dāng)然，除了氨基酸組成會(huì)影響抗氧化活性，肽段序列、一級(jí)結(jié)構(gòu)以及活性位點(diǎn)也會(huì)影響其抗氧化活性[33]。

2.3 牦牛血抗氧化低聚肽體外抗氧化活性的分析

2.3.1 不同牦牛血抗氧化低聚肽對(duì)·OH的IC50值

由表5可知，超濾分級(jí)得到的分子量<1 kDa 牦牛血抗氧化低聚肽對(duì)·OH的IC50值為0.76 mg/mL,極顯著高于分子量< 5 kDa牦牛血低聚肽(P<0.01)。比Sephadex G-25分離純化得到的峰Ⅰ組分的·OH清除能力略差，但差異不顯著(P>0.05)，其清除·OH的IC50值為0.72 mg/mL。因此，采用超濾分級(jí)制備分子量<1 kDa 牦牛血抗氧化低聚肽是可行的。

表4 分子質(zhì)量<1 kDa牦牛血低聚肽的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of yak blood oligopeptides with molecular weight less than 1 kDa

表5 不同牦牛血低聚肽對(duì)·OH的IC50值的比較Table 5 Comparison of IC50values of different yak blood oligopeptides on ·OH

2.3.2 分子量<1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽的體外抗氧化活性

牦牛血抗氧化低聚肽和大豆低聚肽體外抗氧化活性的 IC50值見表6。由表6可知，牦牛血抗氧化低聚肽的總抗氧化能力極顯著優(yōu)于大豆低聚肽(P<0.01)；牦牛血抗氧化低聚肽的還原能力與大豆低聚肽差異不顯著(P>0.05)；牦牛血抗氧化低聚肽對(duì)脂質(zhì)過氧化抑制能力、對(duì)·OH自由基的清除能力極顯著優(yōu)于大豆低聚肽(P<0.01)；牦牛血抗氧化低聚肽對(duì) DPPH· 的清除能力極顯著優(yōu)于大豆低聚肽(P<0.01)；但是，牦牛血抗氧化低聚肽對(duì) ABTS+· 的清除能力卻低于大豆低聚肽(P>0.05)。以上數(shù)據(jù)說明，本實(shí)驗(yàn)制備的牦牛血抗氧化低聚肽的抗氧化活性優(yōu)于商品化的大豆低聚肽，牦牛血抗氧化低聚肽具有作為天然抗氧化劑開發(fā)的潛力。

表6 兩種低聚肽體外抗氧化活性的IC50值Table 6 IC50 value of antioxidant activity of two oligopeptides in vitro

注：與大豆低聚肽相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3.3 牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的驗(yàn)證分析

圖1-A是堿性蛋白酶液、枯草芽孢桿菌液以及牦牛血對(duì)·OH的清除率。牦牛血的·OH清除率為19.14%，可能與血液本身含有抗氧化成分[14-16]有關(guān)；而堿性蛋白酶液和枯草芽孢桿菌液的·OH清除率較低，分別為8.57%和9.53%。此結(jié)果提示，堿性蛋白酶、枯草芽孢桿菌以及牦牛血本身的·OH的清除能力較弱。

圖1 制備工藝對(duì)牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of preparation process on antioxidant activity of yak blood antioxidant oligopeptides

如圖1-B所示，用蒸餾水代替牦牛血進(jìn)行發(fā)酵、酶解以及<1 kDa超濾分級(jí)，得到的發(fā)酵液、酶解液、超濾液對(duì)·OH清除率分別為6.21%、9.59%、1.14%，而牦牛血的發(fā)酵液、酶解液以及<1 kDa 超濾液對(duì)·OH清除率分別為74.48%、93.62%、97.27%，差異極顯著(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明牦牛血蛋白質(zhì)在發(fā)酵、酶解過程中形成的寡肽以及低聚肽貢獻(xiàn)了牦牛血抗氧化低聚肽的抗氧化活性。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證牦牛血抗氧化低聚肽的肽段是其抗氧化活性的主要來源，實(shí)驗(yàn)采用蛋白酶K對(duì)分子量<5 kDa和分子量<1 kDa 的牦牛血抗氧化低聚肽進(jìn)行徹底水解，結(jié)果見圖1-C。分子量<5 kDa牦牛血抗氧化低聚肽(5 mg/mL)經(jīng)蛋白酶K水解后對(duì)·OH清除率由95.89%下降到25.55%(P<0.01)，而分子量<1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽(5 mg/mL)經(jīng)蛋白酶K水解后對(duì)·OH清除率由97.27%下降到24.23%(P<0.01)，可能是由于蛋白酶K水解低聚肽形成了較多的游離氨基酸，從而導(dǎo)致低聚肽對(duì)·OH清除能力的顯著下降。

綜上，牦牛血蛋白質(zhì)經(jīng)過枯草芽孢桿菌發(fā)酵以及堿性蛋白酶水解后得到的肽段是牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的主要來源，而枯草芽孢桿菌、堿性蛋白酶對(duì)牦牛血抗氧化低聚肽的抗氧化活性影響較小。

2.4 分子量<1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽抗缺氧活性的初探

對(duì)照組、陽性對(duì)照組(紅景天組)、牦牛血抗氧化低聚肽高、中、低劑量組小鼠的體重變化見表7。表7顯示，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行分組時(shí)的體重差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明灌胃前的實(shí)驗(yàn)小鼠的體重幾乎一致；灌胃30 d后，5組小鼠均較分組時(shí)的體重有不同幅度的提高，但是紅景天組和牦牛血抗氧化低聚肽高中低劑量組的小鼠體重增加幅度均低于對(duì)照組，特別是牦牛血抗氧化低聚肽高劑量組小鼠體重與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。可能是因?yàn)殛笈Ｑ寡趸途垭木哂锌辔?，劑量越?苦味越重從而影響小鼠的自由攝食。如果開發(fā)保健食品或功能食品配料，建議可以采用微膠囊包埋技術(shù)解決牦牛血抗氧化低聚肽苦味的問題。

表7 牦牛血抗氧化低聚肽對(duì)小鼠體重的影響Table 7 Effect of yak blood antioxidant Oligopeptide on body weight of mice

注：與對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與紅景天組相比，*P<0.05，**P<0.01。下同。

由表8可知，對(duì)照組、紅景天組、牦牛血抗氧化低聚肽高中低劑量組小鼠灌胃30 d后空腹的血紅蛋白含量差異均不顯著(P>0.05)。經(jīng)常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)后，自每只小鼠眼眶內(nèi)眥靜脈叢采血測(cè)定血紅蛋白含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性對(duì)照組(紅景天組)、牦牛血中劑量組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；牦牛血低聚肽低劑量組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，高劑量組與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)；牦牛血抗氧化低聚肽高、中、低劑量組與陽性對(duì)照組(紅景天組)差異不顯著。此結(jié)果提示，在缺氧條件下牦牛血抗氧化低聚肽中、高劑量組具有明顯的提高小鼠全血血紅蛋白含量的作用。

表8 牦牛血抗氧化低聚肽對(duì)小鼠Hb的影響 單位：g/L

缺氧對(duì)機(jī)體是一種緊張性刺激，影響機(jī)體各種代謝，特別是影響機(jī)體的氧化功能，最終會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的心、腦等主要器官功能不足而死亡。牦牛血抗氧化低聚肽在常壓密閉缺氧過程中顯示了較高的抗缺氧活性，見表9。

表9 牦牛血抗氧化低聚肽對(duì)小鼠常壓缺氧存活時(shí)間的影響Table 9 Effects of yak blood antioxidative oligopeptides on the survival time of mice under normal pressure hypoxia

注：延長(zhǎng)率=(藥物組存活時(shí)間-對(duì)照組存活時(shí)間)/對(duì)照組存活時(shí)間。下同。

與對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組、牦牛血抗氧化低聚肽中、低劑量組雖然均能夠延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間，但無顯著性差異(P>0.05)；牦牛血抗氧化低聚肽高劑量組能顯著延長(zhǎng)常壓缺氧小鼠的存活時(shí)間(P<0.05)；與陽性對(duì)照組比較，延長(zhǎng)率達(dá)到了23.5%，差異極顯著(P<0.01)。

亞硝酸鈉使正常二價(jià)鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)變成三價(jià)鐵血紅蛋白，破壞血紅蛋白攜氧能力，造成組織缺氧死亡。與對(duì)照組比較，紅景天陽性對(duì)照組雖然能夠延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間，但是無顯著性差異(P>0.05)；牦牛血抗氧化低聚肽高、中、低劑量組均能延長(zhǎng)缺氧小鼠的存活時(shí)間，高、中劑量組的小鼠存活時(shí)間延長(zhǎng)率極顯著高于陽性對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)果見表10。

表10 牦牛血抗氧化低聚肽對(duì)小鼠亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間的影響Table 10 Effects of yak blood antioxidative oligopeptides on the survival time of sodium nitrite poisoning in mice

常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與對(duì)照組比較，存活時(shí)間延長(zhǎng)并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則可判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性，即適當(dāng)劑量的牦牛血抗氧化低聚肽具有提高小鼠缺氧耐受力的作用。

3 討論與結(jié)論

1 kDa 超濾分級(jí)制備的牦牛血抗氧化低聚肽是1個(gè)低聚肽的混合物，其·OH清除能力、DPPH·清除能力、總抗氧化力以及脂質(zhì)過氧化抑制能力均極顯著優(yōu)于商品化大豆肽(P<0.01)。因此，菌酶發(fā)酵結(jié)合超濾分級(jí)制備牦牛血抗氧化低聚肽是可行的，且牦牛血抗氧化低聚肽可作為一種天然抗氧化劑做進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。

缺氧會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體氧敏感性途徑活化，催化線粒體通過Fenton反應(yīng)和Haber-Weiss反應(yīng)生成自由基[34]，影響機(jī)體正常的氧化分解供能作用。SCHREIBER等[35]發(fā)現(xiàn)維生素E和維生素C的自由基清除作用可以延長(zhǎng)急性缺氧小鼠的存活時(shí)間。AL-HASHEM[36]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充維生素E和維生素C可以對(duì)抗高原缺氧引起的大鼠肺損傷。樊鵬程等[37]首次證實(shí)咪唑啉類自由基清除劑具有抗高原缺氧作用，其機(jī)制為清除減壓缺氧導(dǎo)致的體內(nèi)過量ROS等自由基產(chǎn)生，即缺氧損傷的發(fā)生和線粒體內(nèi)自由基釋放增加密切相關(guān)[38]。牦牛血抗氧化低聚肽具有良好的體外抗氧化活性，因此本實(shí)驗(yàn)通過常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)初步探究了牦牛血抗氧化低聚肽的抗缺氧活性。常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量的牦牛血抗氧化低聚肽對(duì)小鼠常壓缺氧耐受力均有不同程度的提高，并呈現(xiàn)劑量依賴性。高劑量組能顯著延長(zhǎng)常壓缺氧小鼠的存活時(shí)間(P<0.05)；亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)顯示，牦牛血抗氧化低聚肽高、中、低劑量組均能延長(zhǎng)缺氧小鼠的存活時(shí)間，高、中劑量組的存活時(shí)間延長(zhǎng)率極顯著高于陽性對(duì)照組(P<0.01)。本研究結(jié)果提示，牦牛血抗氧化低聚肽具有提高小鼠抗缺氧應(yīng)激的能力，可為抗缺氧保健食品做進(jìn)一步研究。