劉學(xué)云，于新，何嘉敏，郭靖，王萍，王仲芬

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州，510000)

益生菌是指一類可通過改善腸道菌群平衡而對(duì)人的健康產(chǎn)生有利影響的活性微生物添加劑，已被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中[1-2]。諾貝爾獎(jiǎng)的獲得者ELIE METCHNIKOFF認(rèn)為，保加利亞人之所以長壽，是因?yàn)樗麄冮L期飲用發(fā)酵乳制品，其中的乳酸桿菌能改善人的腸道菌群平衡，從而降低產(chǎn)毒菌的活性[3]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)[4]，益生菌的活性在改善人體腸道內(nèi)的菌群平衡中發(fā)揮決定性作用，要獲得較好的治療效果，益生菌必需達(dá)到一定的數(shù)量。但是，由于益生菌的活菌期時(shí)間短[5]，在加工和貯藏過程中保證生物活性是其產(chǎn)品面臨的巨大挑戰(zhàn)[6]。

目前，為了解決上述問題，提高生產(chǎn)效率與產(chǎn)品質(zhì)量，開發(fā)出一種新的綠色無污染生產(chǎn)發(fā)酵模式——混合發(fā)酵[7-8]。利用菌種之間的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，一株菌的代謝物可能刺激另一株菌生長代謝，從而產(chǎn)生單菌發(fā)酵無法獲得的產(chǎn)物及高活菌數(shù)。但是，菌種之間是否會(huì)產(chǎn)生拮抗作用、引起拮抗作用的原因，以及哪些菌種之間有協(xié)同作用是需要關(guān)注的問題。鑒于此，本文研究的重點(diǎn)就是雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、鏈球菌屬的9種常用的益生菌間的相互作用，對(duì)菌種之間的協(xié)同作用機(jī)理進(jìn)行初步的探討，為益生菌混合發(fā)酵、微生物制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbruechiisubsp.Bulgaricus，Ld)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，Lpl)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus，St)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，Lr)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，La)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis，Bl)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum，Bb)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei，Lc)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei，Lpa)，丹尼斯克(中國)有限公司。

1.1.2 試劑與設(shè)備

TU-1901型雙光束紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；5810R型高速冷凍離心機(jī)，廣州卓越貿(mào)易有限公司；2.5 L三菱厭氧產(chǎn)氣袋，廣州卓森科學(xué)器材有限公司；0.22 μm水系濾膜，Millipore公司。

1.1.3 試劑及培養(yǎng)基的配制

(1)MRS培養(yǎng)基

葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取粉5 g，檸檬酸二銨2 g，K2HPO42 g，乙酸鈉5 g，MgSO40.58 g，MnSO40.25 g，吐溫-80 1.0 mL，瓊脂15 g蒸餾水1 000 mL，用1.0 mol/mL的NaOH調(diào)pH 6.2～6.4。

(2)菌液的制備

益生菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，用0.9%無菌生理鹽水梯度稀釋后即為菌液。

(3)無細(xì)胞上清液的制備(cell-free supernatant，CFS)

益生菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，10 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后即為無細(xì)胞上清液[9]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將冷凍保藏的菌種用接種環(huán)挑取一環(huán)接種于MRS固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h左右，直至出現(xiàn)明顯的菌落，如此反復(fù)2次之后，挑取1環(huán)單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中于 37 ℃培養(yǎng)24 h[10]。

1.2.2 活菌數(shù)的測(cè)定

采用平板菌落計(jì)數(shù)法[11]。

1.2.3 菌體濃度的測(cè)定

以未接種的MRS液體培養(yǎng)基為空白，取其菌液于600 nm的波長下，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液的OD600nm。

1.2.4 菌種間拮抗作用實(shí)驗(yàn)

采用牛津杯擴(kuò)散法[12]。

1.2.5 拮抗作用驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將益生菌之間抑菌圈直徑10 mm實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行驗(yàn)證：指示菌液和拮抗菌無細(xì)胞上清液(CFS)按照1∶9的比例混合，以指示菌液+含1 g/L蛋白胨的0.9%無菌生理鹽水作為陽性對(duì)照，以0.9%無菌生理鹽水+拮抗菌CFS作為陰性對(duì)照。在37 ℃培養(yǎng)條件下分別于0、1.5、3、6、12、24 h取5 mL測(cè)定OD600nm。

1.2.6 菌種間協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)

將活化好的菌種按1%接種量接于MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)；同時(shí)在相同的接種量情況下，按1∶1比例把無拮抗作用的菌種兩兩組合進(jìn)行混合發(fā)酵，以不接菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h，每2 h取樣測(cè)定菌液OD600 nm值，并繪制出生長曲線圖[13],以觀察乳酸菌單獨(dú)培養(yǎng)及混合發(fā)酵的生長變化，判斷是否存在協(xié)同作用。

1.2.7 協(xié)同作用生物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將具有協(xié)同作用的一種菌的CFS與MRS液體培養(yǎng)基混合，按照1∶1的比例接入待檢菌；再將一種菌進(jìn)行高壓滅菌熱處理后，按1∶1的比例接入待測(cè)菌，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)其活菌數(shù)，比較單獨(dú)培養(yǎng)與上述培養(yǎng)方式的活菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種間拮抗實(shí)驗(yàn)

采用牛津杯擴(kuò)散法對(duì)這9株益生菌進(jìn)行體外拮抗實(shí)驗(yàn)，如表1所示。

表1 益生菌間的抑菌效果Table 1 Antimicrobial effects between probiotics

注：“×”代表未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；“—”代表無拮抗作用；抑菌圈數(shù)據(jù)為重復(fù)3次平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

約1/3的益生菌之間有一定的拮抗作用，其中Ld對(duì)Lpl、La有抑制作用，但對(duì)Bl、Lr、Bb、Lc、Lpa和St無拮抗作用；Lpl對(duì)Ld、Lr、Lc有抑制作用，但對(duì)Bl、La、Bb、Lpa和St無拮抗作用；Bl對(duì)Lr、La有抑制作用，對(duì)Lpa有明顯的抑制作用，但對(duì)Ld、Lpl、Bb、Lc和St無拮抗作用；Lr對(duì)La有抑制作用，對(duì)St的抑制作用顯著，但對(duì)Ld、Lpl、Bl、Bb、Lc和Lpa無拮抗作用；La對(duì)Ld有抑制作用，對(duì)Lpl、Bl、Lpa有一定的抑制作用但不顯著，對(duì)Lr、Bb、Lc和St無拮抗作用；Bb對(duì)Lpl、Lr、La有抑制作用，對(duì)St拮抗作用最為明顯，抑菌圈高達(dá)19.3 mm，但對(duì)Ld、Bl、Lc和Lpa無拮抗作用；Lc對(duì)Lpl有抑制作用，對(duì)Ld的抑制作用顯著，但對(duì)其余6株菌之間無拮抗作用；Lpa對(duì)Lpl的抑制作用明顯，對(duì)La的有一定的抑制作用但不顯著，但對(duì)Ld、Bl、Lr、Bb、Lc和St無拮抗作用；St對(duì)Lpa的抑制作用不顯著，對(duì)其余7株菌的生長繁殖均無抑制作用。而引起益生菌之間產(chǎn)生拮抗作用的原因，除發(fā)酵培養(yǎng)最終代謝物的乳酸以外，還產(chǎn)生H2O2[14]、乙醇、細(xì)菌素[15]、羅伊氏素[16]、乙酸和雙乙酰[17]等抑菌代謝物。

2.2 拮抗作用的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由表2可知，陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和拮抗實(shí)驗(yàn)組在0～3 h均無明顯增長，說明0～3 h為延滯期即開始緩慢生長，但從3 h后陽性對(duì)照組呈指數(shù)增長趨勢(shì)，此時(shí)菌液中的代謝產(chǎn)物迅速積累，菌液也開始變渾濁，OD600nm值顯著上升，而陰性對(duì)照組與拮抗實(shí)驗(yàn)組均無明顯變化，這說明La的代謝產(chǎn)物對(duì)Lpl、Bl、Lpa有抑制作用，Lpa的代謝產(chǎn)物對(duì)La也有抑制作用；St的代謝產(chǎn)物產(chǎn)物對(duì)Bb有抑制作用。

表2 拮抗菌對(duì)指示菌的拮抗作用Table 2 Antagonistic effect of antagonistic bacteria on the indicator bacterium

注：表中數(shù)據(jù)為含10%指示菌的拮抗菌無細(xì)胞上清液在不同時(shí)間下600 nm波長的吸光值。

2.3 菌種協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)

由圖1可知，在0～4 h為延滯遲緩期即開始緩慢生長；4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期，此時(shí)菌液中的乳酸、蘋果酸、檸檬酸等[18]有機(jī)酸，迅速累積導(dǎo)致其pH值隨之降低，溶液中的其他代謝產(chǎn)物也隨之積累，此時(shí)菌液也開始出現(xiàn)渾濁；到10 h左右益生菌進(jìn)入生長穩(wěn)定期，此時(shí)菌株增長緩慢趨于平緩；再經(jīng)過約18 h后進(jìn)入生長衰退期，此時(shí)由于代謝產(chǎn)物增多，培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)減少，pH迅速下降，菌的生長受到抑制，并開始出現(xiàn)“自溶”[19]現(xiàn)象，大量菌體死亡。同時(shí)比較這9株益生菌在單獨(dú)純培養(yǎng)與兩兩組合共培養(yǎng)時(shí)菌液的OD600nm值變化發(fā)現(xiàn)，St分別與La、Ld、Lc共培養(yǎng)，Lc與La共培養(yǎng)在生長過程中所測(cè)得OD600nm值均明顯高于單菌純培養(yǎng)，從而推出Ld與St、St與La、St與Lc、Lc與La存在協(xié)同互生的關(guān)系，其余的菌種則是存在種間共存的關(guān)系。

圖1 益生菌單菌培養(yǎng)及兩兩組合共培養(yǎng)的生長曲線Fig.1 The growth curve of probiotic single bacteria culture and two-two combination co-culture

2.4 協(xié)同作用的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

如圖2所示，加入StCFS可使La、Ld、Lc的活菌數(shù)較單菌培養(yǎng)明顯升高，同理,另一種菌CFS也可使具有協(xié)同作用的菌種活菌數(shù)較單菌培養(yǎng)顯著增加。因此，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)一致，即St與Ld、St與La、La與Lc、St和Lc具有協(xié)同作用。還發(fā)現(xiàn)高壓滅菌較過濾除菌的無細(xì)胞上清液活菌總數(shù)均小，這表明具有協(xié)同作用的代謝產(chǎn)物部分被熱破壞，菌種之間的協(xié)同作用與代謝產(chǎn)物有關(guān)。如保加利亞乳桿菌因不含有葉酸[20]、丙酮酸而缺少了生長所需的嘌呤[21]和甲酸，但St在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的甲酸和丙酮酸會(huì)刺激保加利亞乳桿菌生長；而保加利亞乳桿菌產(chǎn)生的多肽和氨基酸類也可以促進(jìn)St的生長代謝。

3 討論

通過對(duì)9種益生菌之間相互作用的研究，約1/3的益生菌之間都存在著拮抗作用，但Ld與St、St與La、St與Lc、Lc與La存在協(xié)同互生作用，且代謝產(chǎn)物與菌種間的協(xié)同作用有極大的關(guān)系。出現(xiàn)這種結(jié)果，可以從3個(gè)方面進(jìn)行解釋：(1)微生態(tài)環(huán)境：益生菌的生長受生存環(huán)境的酸度、溫度影響，不同益生菌的產(chǎn)酸能力、耐酸能力及最適生長溫度等構(gòu)成的復(fù)雜生態(tài)關(guān)系，同時(shí)也是制約混合培養(yǎng)過程中各益生菌生長的重要因素；(2)營養(yǎng)物質(zhì)：益生菌生長需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)，菌種之間存在營養(yǎng)物競爭的關(guān)系；(3) 生理生化代謝：益生菌生長繁殖過程中可產(chǎn)生不同的代謝物，當(dāng)一種菌產(chǎn)生的代謝物可以被另一種菌利用刺激其生長，即為協(xié)同作用，反之，如產(chǎn)生細(xì)菌素、H2O2、羅伊氏素(reuteri)等抑菌物質(zhì)，對(duì)另一種菌產(chǎn)生抑制甚至是毒害作用。

圖2 益生菌之間的相互促進(jìn)作用Fig.2 The mutual promoting effect between Lactic acid bacteria

SKRIVER等[22]提出將不同的益生菌進(jìn)行組合可以發(fā)揮其不同的發(fā)酵性能；Lc和St混合發(fā)酵能明顯增加乳品的黏性和活菌數(shù)[23- 24]；舒國偉等發(fā)現(xiàn)Lc和St混合發(fā)酵對(duì)產(chǎn)酸速率、活菌數(shù)及酸羊乳的口感皆有較顯著的影響[25]；St刺激保加利亞乳桿菌生長的代謝產(chǎn)物是甲酸、丙酮酸和葉酸[26]。這些益生菌間的協(xié)同作用與本文研究結(jié)論一致，這可能是因?yàn)槿闂U菌有較強(qiáng)的分解蛋白質(zhì)的能力，能產(chǎn)生多種氨基酸，為St提供營養(yǎng)物質(zhì)；同時(shí)由于桿菌產(chǎn)酸速率較慢，而St分解大分子的蛋白質(zhì)較弱，但可以通過丙酮酸等快速代謝產(chǎn)生乳酸、甲酸、CO2等，這些有機(jī)酸是桿菌的生長刺激物，促進(jìn)乳桿菌的生長。

本研究為益生菌發(fā)酵食品及微生物制劑的工業(yè)化應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)指導(dǎo)；為研究菌種間相互作用及益生菌菌劑組分提供理論基礎(chǔ)。而隨著益生菌被廣泛的應(yīng)用，相互作用研究得不斷深入，發(fā)酵技術(shù)的不斷革新，必將推動(dòng)整個(gè)益生菌行業(yè)發(fā)展進(jìn)程。但從當(dāng)前的研究報(bào)道來看，微生物混合發(fā)酵研究更多地局限于工藝的優(yōu)化，而對(duì)菌種與菌種之間的拮抗和協(xié)同作用機(jī)理研究較少，對(duì)于具有協(xié)同關(guān)系菌株的篩選缺乏有效的方法與理論指導(dǎo)。因此，多菌種培養(yǎng)過程中菌種間的作用機(jī)理、具體的代謝產(chǎn)物、如何降低拮抗作用也是今后研究工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)。