劉春瑩，胡善松，張慶芳，李美玉，于爽，遲乃玉*

1(大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連，116622) 2(遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心(大連大學(xué))，遼寧 大連，116622)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidace,GOD)能高度、專一性地催化β-D-葡萄糖與空氣中的氧反應(yīng)，使葡萄糖氧化成為葡萄糖酸和過氧化氫[1-3]。GOD具有去葡萄糖、脫氧、殺菌等作用，而且安全、無毒副作用，在食品的加工保鮮[4-5]、血糖檢測[6-7]以及飼料加工等方面都有廣泛的應(yīng)用[8]。目前，工業(yè)生產(chǎn)GOD酶制劑的方式以微生物發(fā)酵為主，生產(chǎn)菌株主要是黑曲霉和青霉屬[9-12]，但存在副產(chǎn)物多、分離純化困難的問題，霉菌所產(chǎn)GOD多為中高溫酶，在低溫食品保鮮及飼料保鮮等方面應(yīng)用效果不理想。

開發(fā)海洋生物資源是我國海洋強國戰(zhàn)略的重要內(nèi)容，也是全世界海洋國家的競爭焦點。相對于陸源生物，海洋生物因其特殊的棲息環(huán)境，產(chǎn)生的酶具有耐壓、耐堿、耐鹽、耐冷等顯著特征，更符合現(xiàn)代生物技術(shù)以及不同加工產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用要求?！昂Ｑ竺傅耐诰蚣皯?yīng)用”已成為目前酶制劑企業(yè)競爭的新熱點[13-16]。

相對于霉菌，細菌中GOD的提取、純化更簡便易行。此外，發(fā)酵液中的蛋白種類較少，使得后期的純化也更加容易，在工業(yè)生產(chǎn)中更具優(yōu)勢。

目前，細菌GOD相關(guān)文獻報道較少，葉日英、石淑鈺等[17-18]得到的細菌GOD酶活較低，急需提高。誘變育種是通過誘變處理提高菌種的突變幾率，擴大變異幅度，從中選出具有優(yōu)良特性的變異菌株。誘變育種和其他育種方法相比，具有速度快、收效大、方法簡便等優(yōu)點，是野生GOD細菌選育的一種重要方法。

本文以渤海海域海泥為樣品，通過平板顯色和酶活測定，篩選獲得高產(chǎn)低溫GOD的野生細菌8-Ⅲ，再利用紫外誘變、化學(xué)誘變、紫外-化學(xué)復(fù)合誘變的方法對其進行誘變處理，獲得高產(chǎn)低溫GOD并且性能穩(wěn)定的優(yōu)良菌株，為GOD在低溫保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

海泥(123°371’E，39°6972’N)樣品取自大連地區(qū)渤海海域，水深20～30 m的海底。

1.1.2 試劑

(NH4)2HPO4、CaCO3、亞甲基藍、瓊脂、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4、KCl、NaNO3、酵母提取物、蛋白胨、NaCl；1.0×10-3mol/L鄰聯(lián)茴香胺溶液；0.2 mol/L辣根過氧化物酶溶液(pH 5.2)；上述試劑中NaCl、鄰聯(lián)茴香胺、亞甲基藍和辣根過氧化物酶等均為分析純試劑，其余均為化學(xué)純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨3，(NH4)2HPO40.4，KH2PO40.2，MgSO40.16，CaCO33.5，KI 2，可溶性淀粉10，瓊脂20，pH 6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨3，KH2PO42，MgSO40.7%，KCl 0.5，NaNO340，pH 7.0。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.0。

1.1.4 儀器

Multiskan1510酶標儀,Thermo Fisher Scientific；LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；LTI-700恒溫培養(yǎng)箱,上海愛郎儀器有限公司；HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱,上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HD-1360超凈工作臺,北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；AL-204電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司；自動微生物鑒定系統(tǒng),BiOLOG MicoStation。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)GOD細菌初步篩選

稱取5 g海泥加入裝有100 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中,制成原液，然后按10倍稀釋法用無菌生理鹽水將樣品原液依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6溶液。用移液槍分別吸取1 mL的10-4、10-5、10-6稀釋溶液加入篩選培養(yǎng)基平皿中，設(shè)計3組平行實驗，置于25 ℃下培養(yǎng)5 d左右，觀察菌落及其周圍培養(yǎng)基是否出現(xiàn)藍紫色透明圈。挑選藍紫色透明圈的菌落進行純化培養(yǎng)。

1.2.2 產(chǎn)GOD優(yōu)勢細菌株的重復(fù)篩選及其酶活性檢測

將初篩得到的純化菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，置于25 ℃搖瓶發(fā)酵4 d，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min。在96孔板中依次加入質(zhì)量分數(shù)為5%葡萄糖溶液150 μL，鄰聯(lián)茴香胺溶液150 μL和辣根過氧化物酶溶液10 μL，并將該反應(yīng)體系置于25 ℃恒溫靜置10 min，然后加入10 μL粗酶液。設(shè)定酶標儀波長為460 nm，每間隔1 min測定吸光度A，連續(xù)測量5 min，設(shè)置3組平行實驗。根據(jù)公式(1)、(2)和(3)計算酶活[19]：

(1)

(2)

(3)

式中：11.3,消光系數(shù)；t,反應(yīng)時間，min；V1,酶液體積，mL；V2,反應(yīng)液總體積，mL；f,酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.3 菌株鑒定

參考相關(guān)文獻[20-22]，觀察菌落在平板上形狀、大小、透明度、顏色、邊緣和表面等特征。

利用自動微生物鑒定系統(tǒng)對菌株8-III進行明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉酶的活性、纖維素生長試驗、硫化氫試驗、碳源的利用等生理生化鑒定。

將樣品送往大連寶生物公司進行16S rDNA鑒定。

1.2.4 紫外誘變

菌體在斜面培養(yǎng)后用20 mL生理鹽水重懸，倒入空平板中，并將平板置于磁力攪拌器上攪拌，在20 W紫外燈照射下，處理5、10、15、20、25 min[23-24]。然后稀釋涂布，25 ℃培養(yǎng)2～3 d。

1.2.5 化學(xué)誘變

此次個人所得稅法改革取得的突破性進展，就是實現(xiàn)了從分類征收到綜合與分類相結(jié)合的稅制，而邁出這一步，中國用了22年時間。

取0.4 mL菌液，加入0.5 mL醋酸緩沖液(0.2 mol/L，pH 4.4)，再加入0.1 mL(5 mg/mL)亞硝酸鈉溶液，于25 ℃條件下處理一定時間(10、20、30、40、50 min)后，加入5倍的pH 8.6磷酸緩沖液解毒，重懸后涂布，在25 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d[25-26]。

1.2.6 復(fù)合誘變

復(fù)合誘變采用先紫外誘變，后化學(xué)誘變的方法。

1.2.7 優(yōu)良突變菌株的傳代試驗

對誘變得到的菌株進行酶活測定，將高酶活的優(yōu)良突變菌株在平板上轉(zhuǎn)接5代，發(fā)酵后測定產(chǎn)酶活力，確定其產(chǎn)酶能力是否穩(wěn)定。

1.2.8 粗酶液制備

將發(fā)酵液8 000 r/min離心15 min。取上清液加入飽和(NH4)2SO4溶液至(NH4)2SO4飽和度達到80%，4 ℃過夜。10 000 r/min離心20 min，棄上清，用pH 7.4磷酸緩沖液吹打沉淀至完全溶解，過夜透析。倒入G-100葡聚糖凝膠柱中，用pH 7.4磷酸緩沖液洗脫，并記錄峰值。收集含GOD的過柱液備用。

1.2.9 酶學(xué)性質(zhì)研究

酶最適作用溫度：將適當稀釋的酶液分別在0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下進行反應(yīng)，并按照 1.2.2的方法進行酶活測定。定義酶活最高者為100%，計算相對酶活，從而確定該酶的最適作用溫度。

酶的熱穩(wěn)定性：將適當稀釋的酶液分別放到0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下保溫1 h，每隔30 min取樣，在冰上放置5 min后進行酶活測定。定義未進行熱處理的酶液的酶活為100%，計算相對酶活，以確定重組GOD的熱穩(wěn)定性。

酶最適作用pH值：配制pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的PBS緩沖液，將酶液與緩沖液混合稀釋后進行反應(yīng)，然后按照1.2.2的方法進行酶活測定。定義酶活最高者為100%，計算相對酶活，從而確定GOD酶的最適作用pH。

酶的pH值穩(wěn)定性：分別將酶液在pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0的PBS緩沖液中保溫30 min(溫度為25 ℃)，并按照1.2.2的方法進行酶活測定。定義未經(jīng)保溫處理的酶活為100%，計算殘余酶活力，從而確定GOD酶的pH穩(wěn)定性。

金屬離子對酶活影響：在酶活測定反應(yīng)體系中加入Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+、Ba2+及乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，濃度為0.35 mmol/L，然后按照1.2.2的方法進行酶活測定。定義不加入任何金屬離子的反應(yīng)體系的酶活為100%，計算不同金屬離子或化合物下的相對酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)低溫GOD菌株的篩選

通過對海泥樣品的初步篩選，得到107株菌，分別進行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，同時測定產(chǎn)胞外GOD活力，得到有酶活細菌3株(見表1)，其中菌株8-III產(chǎn)酶活力最高，達到0.75 U/mL,將其作為出發(fā)菌株，進行下一步研究。

表1 野生菌株酶活力Table 1 Enzyme activity of wild strain

2.2 菌株8-III的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征鑒定

菌株8-III在LB培養(yǎng)基上生長快速，25 ℃培養(yǎng)3 d，直徑5～8 mm，菌落呈現(xiàn)乳白色(見圖1-a)，有輕微酸味。通過掃描電鏡觀察，該菌株為無芽孢的中等大小的直桿菌，大小為2.63 μm×(0.276～0.561) μm。菌體兩端鈍圓，多成對存在，也有散在(圖1-b)。

圖1 菌株8-III的菌落形態(tài)(a)和電鏡掃描(b)Fig.1 Strain 8-III colony morphology(a) and electron microscopy(b)

2.2.2 生理生化特性鑒定

菌株經(jīng)自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定的結(jié)果如表2所示。8-III與檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundiistrain ATCC 8090)的相似度為99%，初步鑒定為檸檬酸桿菌屬。

表2 8-III菌株部分生化特征Table 2 Partly biochemical characteristics of strain 8-III

注：“+”為陽性；“-”為陰性。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

菌株8-III的形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)特征與檸檬酸桿菌非常相近，為進一步確定其種屬，對其進行16S rDNA測序。將結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫基因序列進行比較，搜索得到同源性達到99%以上的菌株，均為檸檬酸桿菌。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)特征綜合比較，確定菌株8-III為檸檬酸桿菌屬，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 菌株8-III及其相關(guān)菌株 16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed by the neighbor-joining approach based on the 16S rRNA gene of strain 8-III and related strain

2.3 菌株誘變結(jié)果

2.3.1 紫外誘變結(jié)果

繪制紫外誘變致死率曲線，從圖3可以看出，隨著紫外誘變時間的延長，菌體致死率明顯上升，紫外照射10 min后，菌體的致死率已經(jīng)達到92.79%。工業(yè)育種一般以存活率小于10%的照射量為誘變育種的參考量。故本實驗選取10 min的紫外誘變時間，進行誘變育種。將菌株8-III在紫外條件下處理10 min后，共得到誘變菌株69株，測定其產(chǎn)GOD酶活力。最終得到4株菌株的產(chǎn)酶能力有較大提高，其中突變菌株8-III-a9的產(chǎn)酶活力提高最大，達到原始菌株的1.96倍(表3)。

圖3 菌株8-III紫外誘變致死率曲線Fig.3 UV mutagenic lethal rate of strain 8-III

菌株酶活/(U·mL-1)提升率/%8-III100±2.308-III-a9196±4.2968-III-a22137±1.9378-III-a41169±7.6698-III-a58162±5.562

2.3.2 化學(xué)誘變

由圖4可知，隨著化學(xué)誘變時間的延長，菌體致死率上升，誘變30 min后，菌體的致死率已經(jīng)達到93.3%。故本實驗選取30 min進行化學(xué)誘變育種。將菌株8-III經(jīng)NaNO2處理30 min后，稀釋涂布在LB固體平板上，25 ℃培養(yǎng)3 d，共得到菌株57株。25 ℃，160 r/min搖瓶發(fā)酵2 d，測定GOD酶活，有2株菌株的產(chǎn)酶活力有較大提高，結(jié)果如表4所示。

圖4 菌株8-III化學(xué)誘變致死率曲線Fig.4 Mortality rate of chemical mutagenesis of strain 8-III

菌株名稱酶活/(U·mL-1)提升率/%8-III100±2.308-III-b12134±1.5348-III-b49126±1.826

2.3.3 復(fù)合誘變結(jié)果

先紫外照射10 min，再避光化學(xué)處理30 min。涂布篩選，得菌株63株，測定其產(chǎn)GOD酶活力，有7株菌株的產(chǎn)酶活力有較大提高，結(jié)果如表5所示。其中，復(fù)合誘變后菌株8-III-a44產(chǎn)酶量提高2.36倍。

表5 復(fù)合誘變結(jié)果Table 5 Results of combined mutagenesis

2.4 突變菌株遺傳穩(wěn)定性

對產(chǎn)酶活力提高較大的4株突變株(8-III-c3、8-III-c25、8-III-c44、8-III-a9)進行傳代穩(wěn)定性檢測，結(jié)果如表6所示。8-III-c3從第3代開始，酶活力明顯降低，而8-III-c25、8-III-c44、8-III-a9經(jīng)傳代后酶活穩(wěn)定。

表6 突變菌株遺傳穩(wěn)定性試驗Table 6 Genetic stability of mutants

2.5 酶學(xué)性質(zhì)分析

復(fù)合誘變菌株8-III-a44酶活力最高且傳代穩(wěn)定性最好，因此對菌株8-III-a44所產(chǎn)GOD進行酶學(xué)性質(zhì)研究。

2.5.1 酶最適作用溫度

如圖5所示，酶的最適反應(yīng)溫度為15 ℃，10～35 ℃相對酶活力可以保持在80%以上，高于35 ℃相對酶活力逐漸下降。此外該酶在0 ℃時相對酶活達到60%，符合低溫酶特性。

圖5 溫度對酶活影響Fig.5 Effect of temperature on enzyme activity

2.5.2 酶的熱穩(wěn)定性

如圖6所示，15 ℃為該酶適宜作用溫度，在10～35 ℃時該酶可保持80%以上的相對酶活，40 ℃后穩(wěn)定性迅速下降。此外，該酶在0 ℃時可保持60%以上相對酶活且穩(wěn)定性快速提升，10 ℃后可達到80%以上相對酶活，說明該酶具有低溫酶特性，在低溫下仍可長時間保持較高酶活力。

圖6 酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Enzyme activity and thermal stability

2.5.3 酶最適作用pH值

將菌株8-III-a44所產(chǎn)GOD在pH 4.0～9.0以0.5為梯度孵育5 min，結(jié)果如圖7所示。酶的最適反應(yīng)pH值為6.5，在pH值為6.0～7.5時，有80%以上的相對酶活，表明該酶屬于中性GOD。

圖7 pH值對酶活力的影響Fig.7 Influence of pH on enzymatic activity

2.5.4 酶的pH值穩(wěn)定性

將菌株8-III-a44所產(chǎn)GOD在pH 4.0～10.5以0.5為梯度孵育30 min，結(jié)果如圖8所示。該酶在pH 6.5時穩(wěn)定性最好，在pH 5.5～7.5酶穩(wěn)定性可保持80%以上相對酶活力，pH 9.5以后穩(wěn)定性快速降低。推測GOD在pH 9.5以上會產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化，影響酶活。

圖8 酸堿穩(wěn)定性Fig.8 Acid-base stability

2.5.5 金屬離子及螯合劑對酶活的影響

由表7可知，K+、Ni2+對GOD的活性有明顯促進作用；Na+、Fe3+對誘變菌株GOD活性有一定抑制作用，但殘留相對酶活保持在50%以上；Cu2+、Ag+、Ca2+、Fe2+、EDTA對誘變菌株GOD活性抑制明顯，殘留相對酶活在30%以下，甚至沒有酶活。這可能是由于這些離子與酶中心的功能基團結(jié)合，進而引起酶失活。

表7 金屬離子及螯合劑對8-III-a44酶活力的影響Table 7 Effects of metal ions and chelating agents on 8-III-a44 enzyme activity

3 結(jié)論

本實驗從海泥中分離得到產(chǎn)GOD的細菌8-III，經(jīng)紫外誘變、亞硝酸鹽誘變和二者復(fù)合誘變后酶活力提升2.36倍，說明誘變育種對提升GOD酶活力是一種有效的手段。但誘變菌株8-III-a44酶活力相對于工業(yè)生產(chǎn)菌株的酶活力還有一定差距，如何運用其他手段提升酶活力將會是一個新的研究方向。此外，菌株8-III-a44所產(chǎn)GOD在20 ℃以下時仍具有較高酶活并且穩(wěn)定性良好，在飼料低溫處理方面有很好的應(yīng)用前景。因此8-III-a44具有潛在的開發(fā)利用價值，為GOD的工業(yè)生產(chǎn)提供新型的菌株。