熊關(guān)慶，段 靖，馮 楊，倪 萍，黃小麗*，汪開(kāi)毓，鄧永強(qiáng)，耿 毅，陳德芳，歐陽(yáng)萍，楊世勇

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；3.四川省農(nóng)業(yè)廳，成都 610016）

鯉皰疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2），也稱為金魚(yú)（Carassius auratus）造血器官壞死病病毒（goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV）[1]。CyHV-2 具有極強(qiáng)的宿主特異性，只感染金魚(yú)、鯽魚(yú)及其普通變種[2]。1995年Stephens[3]首次在日本金魚(yú)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CyHV-2。接著在美國(guó)[4]、中國(guó)臺(tái)灣[5]、英國(guó)[6]等國(guó)家和地區(qū)也相繼發(fā)現(xiàn)金魚(yú)感染該病毒，并可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。隨著時(shí)間的推移，該病毒的感染范圍不斷擴(kuò)大。2011年，匈牙利的A.Doszpoly[7]首次在養(yǎng)殖的鯽魚(yú)體內(nèi)檢測(cè)到CyHV-2。隨后，捷克[8]、意大利相繼也有了關(guān)于CyHV-2 感染鯽魚(yú)的報(bào)道。直到2012年，Wang L.等[9]才首次在我國(guó)東部地區(qū)養(yǎng)殖的鯽魚(yú)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CyHV-2。

鯽（Carassius auratus）是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種之一，具有食性雜、適應(yīng)能力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美和營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)[10]。近年來(lái)，我國(guó)鯽魚(yú)的養(yǎng)殖規(guī)模越來(lái)越大，2013年中國(guó)鯽魚(yú)的年產(chǎn)量達(dá)到259.44 萬(wàn)t[11]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中占有舉足輕重的地位。由于養(yǎng)殖密度不斷增大、種質(zhì)退化以及管理不善等多方面因素的影響，我國(guó)鯽魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)受到疾病的威脅和挑戰(zhàn)越來(lái)越大。其中，鰓出血癥是近年來(lái)危害鯽魚(yú)健康養(yǎng)殖的主要疾病，給鯽魚(yú)養(yǎng)殖造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。鰓出血癥成為了阻礙鯽魚(yú)健康養(yǎng)殖的巨大瓶頸，鯽魚(yú)鰓出血癥的正確診斷與防治對(duì)于鯽魚(yú)養(yǎng)殖具有重要意義。

2016年5月，四川某鯽魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)的鯽魚(yú)出現(xiàn)以爛鰓、鰓出血及鰓發(fā)黑為主要癥狀，并伴有魚(yú)鰭末端發(fā)白、鰓蓋出血的大規(guī)模死亡現(xiàn)象，死亡率極大，給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究通過(guò)剖檢觀察、寄生蟲(chóng)學(xué)檢測(cè)、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、病毒學(xué)檢測(cè)等方法，對(duì)發(fā)病鯽魚(yú)進(jìn)行診斷，結(jié)合組織病理技術(shù)檢測(cè)組織病理?yè)p傷程度，擬探尋該病的主要損傷靶器官并分析致病原因，為相關(guān)疾病的診斷提供參考借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

具有典型患病癥狀的鯽魚(yú)5 尾，來(lái)自四川某鯽魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)15～18 cm，用于剖檢觀察和病料采集。送檢時(shí)病魚(yú)存活。

1.2 剖檢觀察

將患病鯽魚(yú)用MS222 麻醉后剖檢。首先檢查病魚(yú)體表完整性及其他體表癥狀，同時(shí)取少量鰓絲和體表黏液壓片，顯微鏡下觀察有無(wú)寄生蟲(chóng)感染。打開(kāi)圍心腔、腹腔依次觀察各內(nèi)臟器官大體病變情況。

1.3 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

無(wú)菌操作條件下從患病魚(yú)的肝臟、脾臟中取樣于LB 培養(yǎng)基上劃線接種，22 ℃恒溫培養(yǎng)，48 h 后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。

1.4 病毒學(xué)檢測(cè)

參照T.B.Waltzek 等[12]設(shè)計(jì)引物對(duì)患病魚(yú)組織進(jìn)行CyHV-2 PCR 檢測(cè)（表1）。取患病魚(yú)肝胰臟、脾臟、腎臟和鰓等組織，根據(jù)TRIzol 試劑盒說(shuō)明書(shū)快速提取DNA，接著進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系為：12.5 μL Mix-reaction buffer，上、下游引物各 1 μL，加入 cDNA 模板 2 μL，8.5 μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃變性 1 min，53 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下分析結(jié)果。PCR 產(chǎn)物經(jīng)DNA 純化試劑盒純化后，送成都擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果在GenBank 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)。

表1 CyHV-2 擴(kuò)增引物Table 1 CyHV-2 amplification primers

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI 的BLAST 查找同源性序列，利用DNAMAN 進(jìn)行序列編輯和比對(duì)分析，MEGA7.0 鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析。

1.6 組織病理?yè)p傷觀察

分別取患病鯽的鰓、肝臟、脾臟、腎臟、心臟、腸、腦等組織器官，用10%的中性緩沖福爾馬林固定液固定，水洗過(guò)夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)切片，蘇木精-伊紅（H.E）染色，中性樹(shù)脂膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理?yè)p傷，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 尸檢與大體病理學(xué)觀察

患病鯽魚(yú)主要表現(xiàn)為尾鰭末端發(fā)白；鰓絲末端輕微腐爛，鰓絲顏色加深，出血樣表現(xiàn)。打開(kāi)腹腔后，可見(jiàn)少量帶血腹水流出（圖1）。寄生蟲(chóng)檢查結(jié)果表明，鰓絲和體表黏液未見(jiàn)明顯的寄生蟲(chóng)寄生。

2.2 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

無(wú)菌條件下，從患病魚(yú)的肝臟、脾臟接種細(xì)菌至LB 培養(yǎng)基，連續(xù)觀察一周，未觀察到細(xì)菌生長(zhǎng)。

圖1 患病鯽魚(yú)臨床特征Figure 1 Clinical characteristics of diseased crucian carp

2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果

提取患病鯽魚(yú)的組織的DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2），位于約370 bp 處均可見(jiàn)特異性DNA 擴(kuò)增條帶，與CyHV-2 預(yù)期大小相符，陰性對(duì)照泳道無(wú)明顯條帶。將測(cè)序結(jié)果在GenBank 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，該序列與GenBank 中CyHV-2 基因有高度同源性，PCR檢測(cè)結(jié)果顯示患病鯽魚(yú)為CyHV-2 陽(yáng)性。

圖2 PCR 檢測(cè)結(jié)果Figure 2 PCR test results

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將測(cè)序結(jié)果上傳到NCBI-GenBank 獲得基因登錄號(hào)：NBK53701，通過(guò)MEGA 7.0 軟件利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3），結(jié)果顯示，F(xiàn)JY 株與CyHV-2聚為一支。同源性分析表明，本試驗(yàn)所分離的病毒與CyHV-2 亞洲株有相對(duì)較高的核酸同源性，同源性達(dá)到80%。

圖3 基于FJY 利用鄰近法構(gòu)建CyHV-2 進(jìn)化樹(shù)Figure 3 CyHV-2 phylogenetic tree constructed by proximity method based on FJY

2.5 病理組織學(xué)觀察

經(jīng)石蠟切片，H.E 染色后觀察發(fā)現(xiàn)，該病靶器官主要為脾臟、鰓、腸道、腎臟、心臟和肝臟，所有魚(yú)均表現(xiàn)為重度壞死性脾炎、重度出血性壞死性鰓炎、重度壞死性腸炎、中度至重度壞死性腎炎、中度壞死性心肌炎和心內(nèi)膜炎、輕度至中度脂肪肝和輕度壞死性肝胰腺炎，其余組織未發(fā)現(xiàn)明顯病變。

脾臟：表現(xiàn)為重度壞死性脾炎。低倍下可觀察到脾臟嚴(yán)重的充血，淋巴細(xì)胞減少（圖4A）；脾實(shí)質(zhì)中可見(jiàn)橋狀相連的壞死灶，伴有有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4B）；脾血管系統(tǒng)受損嚴(yán)重，橢圓體壁及血竇內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重壞死、淡染、空泡化，可見(jiàn)部分細(xì)胞縮小，染色質(zhì)固縮、崩解成大小不等的團(tuán)塊（圖4C）。

鰓：鰓表現(xiàn)為重度出血性壞死性鰓炎。低倍下可觀察到大面積鰓絲出血（圖4D）；高倍下可見(jiàn)鰓小片壞死、脫落中（圖4E）；鰓絲間有脫落堆積的紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞（圖4F）。

腸道：腸道表現(xiàn)為重度壞死性腸炎。腸道黏膜下層和固有層內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4G）；黏膜下層及固有層內(nèi)毛細(xì)血管充血，大量紅細(xì)胞充盈（圖4H）；嚴(yán)重的可見(jiàn)腸絨毛頂端上皮細(xì)胞大量壞死脫落，固有層明顯裸露，內(nèi)可見(jiàn)嚴(yán)重充血的毛細(xì)血管（圖4I）。

腎臟：腎臟表現(xiàn)為中度至重度壞死性腎炎。腎小管上皮細(xì)胞縮小，胞漿濃縮、紅染，上皮細(xì)胞脫落，與基膜分離，部分消失（圖4J）；腎間質(zhì)排列紊亂，細(xì)胞稀疏，間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造血母細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、壞死、崩解成大小不等的團(tuán)塊（圖4K）。腎球囊擴(kuò)張，可見(jiàn)腎小球內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死，細(xì)胞核濃縮、崩解（圖4L）。

心臟：心臟表現(xiàn)為中度壞死性心肌炎和中度心內(nèi)膜炎。心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞壞死，細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)濃縮、消失，心肌纖維橫紋消失，染色不均（圖4M）；部分心肌細(xì)胞核大量減少，呈指環(huán)樣變，偶爾可見(jiàn)心肌纖維內(nèi)白細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維胞漿消失，將白細(xì)胞包裹在內(nèi)，部分區(qū)域心肌纖維呈小灶樣壞死，纖維溶解消失，被大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)取代（圖4N）。

頭腎：頭腎為輕度炎癥。低倍下可觀察到頭腎輕微的充血和少量的炎性細(xì)胞（圖4O）。

肝胰臟：肝臟表現(xiàn)為輕度至中度脂肪肝和輕度壞死性肝胰腺炎。肝血竇大面積淤血（圖4P），肝細(xì)胞腫脹，脂肪變性，部分細(xì)胞壞死、溶解，肝血竇內(nèi)可見(jiàn)炎性細(xì)胞（圖4Q）。胰腺細(xì)胞輕度壞死（圖4R）。

3 討論與結(jié)論

CyHV-2 是危害鯽魚(yú)健康的一種常見(jiàn)病毒，可使機(jī)體處于缺氧、營(yíng)養(yǎng)不足、廢物積累的內(nèi)環(huán)境狀態(tài)，加劇主要的器官組織的損傷，造成鯽魚(yú)大量死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，感染CyHV-2 后，鯽魚(yú)出現(xiàn)尾鰭末端發(fā)白，鰓出血，解剖后腹腔有少量紅色腹水等癥狀。經(jīng)組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)患病魚(yú)表現(xiàn)為明顯的重度壞死性脾炎、中度至重度出血性壞死性鰓炎、重度壞死性腸炎、中度至重度壞死性腎炎、中度壞死性心肌炎和心內(nèi)膜炎、輕度至中度脂肪肝和輕度壞死性肝胰腺炎，說(shuō)明脾臟、鰓、腸道、中腎、心臟是其主要靶器官，對(duì)肝臟和頭腎亦有輕微損傷。2016年林秀秀等[13-14]亦發(fā)現(xiàn)感染CyHV-2 的鯽魚(yú)在頭腎、脾臟、腸道、肝胰腺、鰓中均出現(xiàn)明顯的病理?yè)p傷，而本研究進(jìn)一步明確了鯽魚(yú)感染CyHV-2 后的主要病理靶器官及病變程度，為臨床上相關(guān)疾病的研究提供了參考。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是檢測(cè)CyHV-2 感染較為常用且精準(zhǔn)的方法，可以檢測(cè)到組織中極微量的病毒DNA[15]。本研究參照T.B.Waltzek[16]的檢測(cè)方法，該方法能夠有效地檢測(cè)出不同地方的CyHV-2分離株，最終發(fā)現(xiàn)本次發(fā)病的鯽魚(yú)為CyHV-2 陽(yáng)性。目前，還有更多的檢測(cè)方法用于CyHV-2 檢測(cè)。A.E.Goodwin 等[17]建立了實(shí)時(shí)定量PCR，此方法特異性強(qiáng)，免疫性高，不僅能在表現(xiàn)臨床癥狀的魚(yú)中檢測(cè)出CyHV-2 病毒，還可以檢測(cè)出處于潛伏期的病魚(yú)。He J.等[18]建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增來(lái)檢測(cè)CyHV-2，證實(shí)該方法比傳統(tǒng)的PCR 和實(shí)時(shí)PCR 靈敏度更高。CyHV-2 檢測(cè)技術(shù)仍在發(fā)展，未來(lái)還有很多更快更好的方法會(huì)創(chuàng)造出來(lái)，能夠在生產(chǎn)一線發(fā)揮更大的作用。

CyHV-2 在魚(yú)體內(nèi)形成潛在的感染源。該病毒的暴發(fā)與溫度有很大關(guān)系，潛伏感染的病毒在溫度不適宜時(shí)長(zhǎng)期潛伏在魚(yú)體內(nèi)，表現(xiàn)與正常魚(yú)無(wú)任何差異。但是當(dāng)養(yǎng)殖水溫升高到22 ℃時(shí)，潛伏在魚(yú)體內(nèi)的病毒被激活，導(dǎo)致宿主開(kāi)始發(fā)病并造成疾病的傳播，引起魚(yú)群的大量死亡[19]。因此在春夏季水溫升高時(shí)，要注意養(yǎng)殖鯽魚(yú)的生長(zhǎng)情況，經(jīng)常打樣檢測(cè)，一旦發(fā)現(xiàn)有疑似感染CyHV-2 的癥狀要及時(shí)檢測(cè)并處理，避免大量暴發(fā)造成損失。另外2009年A.E.Goodwind 等[20]證實(shí)了CyHV-2 也可垂直傳播，因此在養(yǎng)殖過(guò)程中需要嚴(yán)格選擇親魚(yú)，并加強(qiáng)對(duì)親魚(yú)場(chǎng)、苗種場(chǎng)的管理。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)CyHV-2 攜帶者的處理尚未有明確的要求和相關(guān)的參考，因此當(dāng)在親魚(yú)和魚(yú)苗中一旦發(fā)現(xiàn)CyHV-2 攜帶者，必須及時(shí)淘汰，避免造成更大的損失。由于我國(guó)對(duì)于皰疹病毒的研究還處于起步階段，對(duì)于該病的治療目前尚無(wú)特效藥。張琳琳等[21]對(duì)CyHV-2 滅活疫苗進(jìn)行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)注射疫苗后相對(duì)免疫保護(hù)力有一定上升，并降低了感染CyHV-2 的異育銀鯽死亡率，因此應(yīng)盡快研制該病毒的滅活疫苗，從源頭上控制該病。

圖4 患病鯽組織病理學(xué)表現(xiàn)Figure 4 Histopathological manifestations of diseased crucian carp