熊關(guān)慶，段 靖，馮 楊，倪 萍，黃小麗*，汪開毓，鄧永強，耿 毅，陳德芳，歐陽萍，楊世勇

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；3.四川省農(nóng)業(yè)廳，成都 610016）

鯉皰疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2），也稱為金魚（Carassius auratus）造血器官壞死病病毒（goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV）[1]。CyHV-2 具有極強的宿主特異性，只感染金魚、鯽魚及其普通變種[2]。1995年Stephens[3]首次在日本金魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CyHV-2。接著在美國[4]、中國臺灣[5]、英國[6]等國家和地區(qū)也相繼發(fā)現(xiàn)金魚感染該病毒，并可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。隨著時間的推移，該病毒的感染范圍不斷擴大。2011年，匈牙利的A.Doszpoly[7]首次在養(yǎng)殖的鯽魚體內(nèi)檢測到CyHV-2。隨后，捷克[8]、意大利相繼也有了關(guān)于CyHV-2 感染鯽魚的報道。直到2012年，Wang L.等[9]才首次在我國東部地區(qū)養(yǎng)殖的鯽魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CyHV-2。

鯽（Carassius auratus）是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一，具有食性雜、適應(yīng)能力強、肉質(zhì)鮮美和營養(yǎng)豐富等優(yōu)點[10]。近年來，我國鯽魚的養(yǎng)殖規(guī)模越來越大，2013年中國鯽魚的年產(chǎn)量達到259.44 萬t[11]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中占有舉足輕重的地位。由于養(yǎng)殖密度不斷增大、種質(zhì)退化以及管理不善等多方面因素的影響，我國鯽魚養(yǎng)殖業(yè)受到疾病的威脅和挑戰(zhàn)越來越大。其中，鰓出血癥是近年來危害鯽魚健康養(yǎng)殖的主要疾病，給鯽魚養(yǎng)殖造成了極大的經(jīng)濟損失。鰓出血癥成為了阻礙鯽魚健康養(yǎng)殖的巨大瓶頸，鯽魚鰓出血癥的正確診斷與防治對于鯽魚養(yǎng)殖具有重要意義。

2016年5月，四川某鯽魚養(yǎng)殖場的鯽魚出現(xiàn)以爛鰓、鰓出血及鰓發(fā)黑為主要癥狀，并伴有魚鰭末端發(fā)白、鰓蓋出血的大規(guī)模死亡現(xiàn)象，死亡率極大，給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟損失。本研究通過剖檢觀察、寄生蟲學(xué)檢測、細(xì)菌學(xué)檢測、病毒學(xué)檢測等方法，對發(fā)病鯽魚進行診斷，結(jié)合組織病理技術(shù)檢測組織病理損傷程度，擬探尋該病的主要損傷靶器官并分析致病原因，為相關(guān)疾病的診斷提供參考借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

具有典型患病癥狀的鯽魚5 尾，來自四川某鯽魚養(yǎng)殖場，體長15～18 cm，用于剖檢觀察和病料采集。送檢時病魚存活。

1.2 剖檢觀察

將患病鯽魚用MS222 麻醉后剖檢。首先檢查病魚體表完整性及其他體表癥狀，同時取少量鰓絲和體表黏液壓片，顯微鏡下觀察有無寄生蟲感染。打開圍心腔、腹腔依次觀察各內(nèi)臟器官大體病變情況。

1.3 細(xì)菌學(xué)檢測

無菌操作條件下從患病魚的肝臟、脾臟中取樣于LB 培養(yǎng)基上劃線接種，22 ℃恒溫培養(yǎng)，48 h 后觀察細(xì)菌生長狀況。

1.4 病毒學(xué)檢測

參照T.B.Waltzek 等[12]設(shè)計引物對患病魚組織進行CyHV-2 PCR 檢測（表1）。取患病魚肝胰臟、脾臟、腎臟和鰓等組織，根據(jù)TRIzol 試劑盒說明書快速提取DNA，接著進行PCR 擴增。PCR 擴增體系為：12.5 μL Mix-reaction buffer，上、下游引物各 1 μL，加入 cDNA 模板 2 μL，8.5 μL ddH2O。PCR 擴增條件：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃變性 1 min，53 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸 1 min，30 個循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL 擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下分析結(jié)果。PCR 產(chǎn)物經(jīng)DNA 純化試劑盒純化后，送成都擎科生物技術(shù)有限公司進行序列測定。將測序結(jié)果在GenBank 上進行BLAST 比對。

表1 CyHV-2 擴增引物Table 1 CyHV-2 amplification primers

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測序結(jié)果通過NCBI 的BLAST 查找同源性序列，利用DNAMAN 進行序列編輯和比對分析，MEGA7.0 鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹進行分析。

1.6 組織病理損傷觀察

分別取患病鯽的鰓、肝臟、脾臟、腎臟、心臟、腸、腦等組織器官，用10%的中性緩沖福爾馬林固定液固定，水洗過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)切片，蘇木精-伊紅（H.E）染色，中性樹脂膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理損傷，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 尸檢與大體病理學(xué)觀察

患病鯽魚主要表現(xiàn)為尾鰭末端發(fā)白；鰓絲末端輕微腐爛，鰓絲顏色加深，出血樣表現(xiàn)。打開腹腔后，可見少量帶血腹水流出（圖1）。寄生蟲檢查結(jié)果表明，鰓絲和體表黏液未見明顯的寄生蟲寄生。

2.2 細(xì)菌學(xué)檢測

無菌條件下，從患病魚的肝臟、脾臟接種細(xì)菌至LB 培養(yǎng)基，連續(xù)觀察一周，未觀察到細(xì)菌生長。

圖1 患病鯽魚臨床特征Figure 1 Clinical characteristics of diseased crucian carp

2.3 PCR檢測結(jié)果

提取患病鯽魚的組織的DNA，進行PCR 擴增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測結(jié)果顯示（圖2），位于約370 bp 處均可見特異性DNA 擴增條帶，與CyHV-2 預(yù)期大小相符，陰性對照泳道無明顯條帶。將測序結(jié)果在GenBank 上進行BLAST 比對，該序列與GenBank 中CyHV-2 基因有高度同源性，PCR檢測結(jié)果顯示患病鯽魚為CyHV-2 陽性。

圖2 PCR 檢測結(jié)果Figure 2 PCR test results

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測序結(jié)果上傳到NCBI-GenBank 獲得基因登錄號：NBK53701，通過MEGA 7.0 軟件利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖3），結(jié)果顯示，F(xiàn)JY 株與CyHV-2聚為一支。同源性分析表明，本試驗所分離的病毒與CyHV-2 亞洲株有相對較高的核酸同源性，同源性達到80%。

圖3 基于FJY 利用鄰近法構(gòu)建CyHV-2 進化樹Figure 3 CyHV-2 phylogenetic tree constructed by proximity method based on FJY

2.5 病理組織學(xué)觀察

經(jīng)石蠟切片，H.E 染色后觀察發(fā)現(xiàn)，該病靶器官主要為脾臟、鰓、腸道、腎臟、心臟和肝臟，所有魚均表現(xiàn)為重度壞死性脾炎、重度出血性壞死性鰓炎、重度壞死性腸炎、中度至重度壞死性腎炎、中度壞死性心肌炎和心內(nèi)膜炎、輕度至中度脂肪肝和輕度壞死性肝胰腺炎，其余組織未發(fā)現(xiàn)明顯病變。

脾臟：表現(xiàn)為重度壞死性脾炎。低倍下可觀察到脾臟嚴(yán)重的充血，淋巴細(xì)胞減少（圖4A）；脾實質(zhì)中可見橋狀相連的壞死灶，伴有有大量的炎性細(xì)胞浸潤（圖4B）；脾血管系統(tǒng)受損嚴(yán)重，橢圓體壁及血竇內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重壞死、淡染、空泡化，可見部分細(xì)胞縮小，染色質(zhì)固縮、崩解成大小不等的團塊（圖4C）。

鰓：鰓表現(xiàn)為重度出血性壞死性鰓炎。低倍下可觀察到大面積鰓絲出血（圖4D）；高倍下可見鰓小片壞死、脫落中（圖4E）；鰓絲間有脫落堆積的紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞（圖4F）。

腸道：腸道表現(xiàn)為重度壞死性腸炎。腸道黏膜下層和固有層內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤（圖4G）；黏膜下層及固有層內(nèi)毛細(xì)血管充血，大量紅細(xì)胞充盈（圖4H）；嚴(yán)重的可見腸絨毛頂端上皮細(xì)胞大量壞死脫落，固有層明顯裸露，內(nèi)可見嚴(yán)重充血的毛細(xì)血管（圖4I）。

腎臟：腎臟表現(xiàn)為中度至重度壞死性腎炎。腎小管上皮細(xì)胞縮小，胞漿濃縮、紅染，上皮細(xì)胞脫落，與基膜分離，部分消失（圖4J）；腎間質(zhì)排列紊亂，細(xì)胞稀疏，間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造血母細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、壞死、崩解成大小不等的團塊（圖4K）。腎球囊擴張，可見腎小球內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死，細(xì)胞核濃縮、崩解（圖4L）。

心臟：心臟表現(xiàn)為中度壞死性心肌炎和中度心內(nèi)膜炎。心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞壞死，細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)濃縮、消失，心肌纖維橫紋消失，染色不均（圖4M）；部分心肌細(xì)胞核大量減少，呈指環(huán)樣變，偶爾可見心肌纖維內(nèi)白細(xì)胞浸潤，心肌纖維胞漿消失，將白細(xì)胞包裹在內(nèi)，部分區(qū)域心肌纖維呈小灶樣壞死，纖維溶解消失，被大量炎性細(xì)胞浸潤取代（圖4N）。

頭腎：頭腎為輕度炎癥。低倍下可觀察到頭腎輕微的充血和少量的炎性細(xì)胞（圖4O）。

肝胰臟：肝臟表現(xiàn)為輕度至中度脂肪肝和輕度壞死性肝胰腺炎。肝血竇大面積淤血（圖4P），肝細(xì)胞腫脹，脂肪變性，部分細(xì)胞壞死、溶解，肝血竇內(nèi)可見炎性細(xì)胞（圖4Q）。胰腺細(xì)胞輕度壞死（圖4R）。

3 討論與結(jié)論

CyHV-2 是危害鯽魚健康的一種常見病毒，可使機體處于缺氧、營養(yǎng)不足、廢物積累的內(nèi)環(huán)境狀態(tài)，加劇主要的器官組織的損傷，造成鯽魚大量死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，感染CyHV-2 后，鯽魚出現(xiàn)尾鰭末端發(fā)白，鰓出血，解剖后腹腔有少量紅色腹水等癥狀。經(jīng)組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)患病魚表現(xiàn)為明顯的重度壞死性脾炎、中度至重度出血性壞死性鰓炎、重度壞死性腸炎、中度至重度壞死性腎炎、中度壞死性心肌炎和心內(nèi)膜炎、輕度至中度脂肪肝和輕度壞死性肝胰腺炎，說明脾臟、鰓、腸道、中腎、心臟是其主要靶器官，對肝臟和頭腎亦有輕微損傷。2016年林秀秀等[13-14]亦發(fā)現(xiàn)感染CyHV-2 的鯽魚在頭腎、脾臟、腸道、肝胰腺、鰓中均出現(xiàn)明顯的病理損傷，而本研究進一步明確了鯽魚感染CyHV-2 后的主要病理靶器官及病變程度，為臨床上相關(guān)疾病的研究提供了參考。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是檢測CyHV-2 感染較為常用且精準(zhǔn)的方法，可以檢測到組織中極微量的病毒DNA[15]。本研究參照T.B.Waltzek[16]的檢測方法，該方法能夠有效地檢測出不同地方的CyHV-2分離株，最終發(fā)現(xiàn)本次發(fā)病的鯽魚為CyHV-2 陽性。目前，還有更多的檢測方法用于CyHV-2 檢測。A.E.Goodwin 等[17]建立了實時定量PCR，此方法特異性強，免疫性高，不僅能在表現(xiàn)臨床癥狀的魚中檢測出CyHV-2 病毒，還可以檢測出處于潛伏期的病魚。He J.等[18]建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴增來檢測CyHV-2，證實該方法比傳統(tǒng)的PCR 和實時PCR 靈敏度更高。CyHV-2 檢測技術(shù)仍在發(fā)展，未來還有很多更快更好的方法會創(chuàng)造出來，能夠在生產(chǎn)一線發(fā)揮更大的作用。

CyHV-2 在魚體內(nèi)形成潛在的感染源。該病毒的暴發(fā)與溫度有很大關(guān)系，潛伏感染的病毒在溫度不適宜時長期潛伏在魚體內(nèi)，表現(xiàn)與正常魚無任何差異。但是當(dāng)養(yǎng)殖水溫升高到22 ℃時，潛伏在魚體內(nèi)的病毒被激活，導(dǎo)致宿主開始發(fā)病并造成疾病的傳播，引起魚群的大量死亡[19]。因此在春夏季水溫升高時，要注意養(yǎng)殖鯽魚的生長情況，經(jīng)常打樣檢測，一旦發(fā)現(xiàn)有疑似感染CyHV-2 的癥狀要及時檢測并處理，避免大量暴發(fā)造成損失。另外2009年A.E.Goodwind 等[20]證實了CyHV-2 也可垂直傳播，因此在養(yǎng)殖過程中需要嚴(yán)格選擇親魚，并加強對親魚場、苗種場的管理。目前，國內(nèi)外對CyHV-2 攜帶者的處理尚未有明確的要求和相關(guān)的參考，因此當(dāng)在親魚和魚苗中一旦發(fā)現(xiàn)CyHV-2 攜帶者，必須及時淘汰，避免造成更大的損失。由于我國對于皰疹病毒的研究還處于起步階段，對于該病的治療目前尚無特效藥。張琳琳等[21]對CyHV-2 滅活疫苗進行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)注射疫苗后相對免疫保護力有一定上升，并降低了感染CyHV-2 的異育銀鯽死亡率，因此應(yīng)盡快研制該病毒的滅活疫苗，從源頭上控制該病。

圖4 患病鯽組織病理學(xué)表現(xiàn)Figure 4 Histopathological manifestations of diseased crucian carp