崔 婧，蘇美丞，譚冬飛，張 霞，賈 曼

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

牛乳因其獨特的口感和豐富的營養(yǎng)價值深受消費者喜愛。目前市場上出售的液態(tài)牛乳主要有巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳，但是，隨著牛乳消費量的增加，原料乳供不應(yīng)求，加之乳粉價格低廉、易于運輸?shù)膬?yōu)勢，有些不法廠商用乳粉勾兌制成復(fù)原乳，冒充超高溫滅菌乳而不加標(biāo)識，極大地?fù)p害了消費者的合法權(quán)益。另一方面，由于乳粉加熱殺菌溫度高于超高溫滅菌乳，且與超高溫滅菌乳相比增加了噴霧干燥這一工藝過程，因此乳粉中的營養(yǎng)物質(zhì)損失較為嚴(yán)重[1-2]。由于復(fù)原乳和超高溫滅菌乳的化學(xué)成分基本相同，因此判別復(fù)原乳和超高溫滅菌乳顯得尤為困難。為了保障消費者的合法權(quán)益，保障牛乳質(zhì)量，尋找合適的區(qū)分復(fù)原乳和超高溫滅菌乳的方法至關(guān)重要。

目前判別復(fù)原乳的指標(biāo)主要集中于糠氨酸[3]、乳果糖[4-6]、羥甲基糠醛、熱變性蛋白[7]等美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，相關(guān)的檢測技術(shù)主要有高效液相色譜法[3,8]、離子色譜法[9]、酶比色法[10-11]等。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新修訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 939—2016《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》[12]利用高效液相色譜法和分光光度法，選取糠氨酸和乳果糖作為復(fù)原乳的標(biāo)示物，通過計算乳果糖和糠氨酸的比值來判別超高溫滅菌乳和復(fù)原乳，該標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法耗時長、前處理復(fù)雜、靈敏度低。Marconi等[13]利用酶比色法測定巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳中乳果糖含量，檢測靈敏度較高。但由于糠氨酸、乳果糖含量不僅受加熱溫度影響，而且還受到貯藏時間的影響[4,14-15]，因此，僅靠糠氨酸、乳果糖2 個指標(biāo)判別超高溫滅菌乳和復(fù)原乳往往容易造成誤判。在這種情況下，尋找快速、準(zhǔn)確判別超高溫滅菌乳和復(fù)原乳的方法顯得尤為重要。

高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜儀由于具有高靈敏度，能夠檢測復(fù)雜樣品中的痕量物質(zhì)，因此被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)分析[16-18]。化學(xué)計量學(xué)方法與代謝組學(xué)分析結(jié)合是目前最為先進(jìn)的分析技術(shù)[19]。Mais等[20]利用超高效液相色譜-四極桿/飛行時間-質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole/time of flight mass spectrometry，UPLC-Q/TOF-MS），采用非靶向代謝組學(xué)的方法，建立正交偏最小二乘方差判別分析模型來區(qū)分不同地理來源的生姜。Zhao Qiqi等[21]利用高分辨質(zhì)譜儀結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法，監(jiān)測到高血脂患者37 種血清代謝物的改變及參與的11 個途徑，為高血脂的早期風(fēng)險評估提供了潛在的生物標(biāo)志物，并為高血脂患者體內(nèi)復(fù)雜的代謝途徑變化提供了進(jìn)一步的見解。

本研究利用高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜儀，采用非靶向代謝組學(xué)方法，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法，找到14 種區(qū)別超高溫滅菌乳和復(fù)原乳的差異物質(zhì)，并建立了區(qū)別2 種乳的判別模型，以期通過篩選出的14 種物質(zhì)建立的判別模型能夠快速、準(zhǔn)確地判別超高溫滅菌乳和復(fù)原乳，為復(fù)原乳的判別提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 種不同品牌超高溫滅菌乳購自北京各大超市，10 種不同全脂基粉采自北京、內(nèi)蒙古、河北和新西蘭。

乙腈（色譜級） 德國Merck公司；乙腈、甲酸（均為質(zhì)譜級） 美國Fisher Scientific公司；Mili-Q系統(tǒng)美國Milipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6545 高分辨四極桿飛行時間液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；ST16R高速冷凍離心機美國Thermo Fisher Scientific公司；ME802E稱量天平瑞士梅特勒-特利多有限公司；Vortex Genius 3渦旋混合儀 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)原乳的配制

按蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為3.0 g/100 mL將乳粉溶于63 ℃熱水中，手搖均質(zhì)30 min，配制成復(fù)原乳。

1.3.2 樣品前處理

吸取2 mL牛乳于15 mL離心管中，8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，重復(fù)3 次；下層轉(zhuǎn)移至新的15 mL離心管中，加入4 mL乙腈，渦旋5 min，10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min；上清液過0.22 μm有機濾膜后，置于進(jìn)樣小瓶中，待測。每個樣品6 個平行。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse C18柱（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；流動相：正離子模式下，流動相A為體積分?jǐn)?shù)為0.2%甲酸水溶液，流動相B為體積分?jǐn)?shù)為0.2%甲酸-乙腈；負(fù)離子模式下，流動相A為5 mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B為5 mmol/L乙酸銨-乙腈；正離子模式下梯度洗脫條件為：0～2.5 min、1%流動相B，2.5～8 min、30%流動相B，8～12 min、50%流動相B，12～20 min、95%流動相B，20～25 min、95%流動相B；負(fù)離子模式下梯度洗脫條件為：0～1 min、2%流動相B，1～2 min、10%流動相B，2～5 min、65%流動相B，5～7 min、95%流動相B，7～15 min、95%流動相B，15～15.5 min、5%流動相B；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

正離子模式：電噴霧離子（electrons pray ionization，ESI）源；干燥器溫度250 ℃；干燥器流速7 mL/min；鞘氣溫度325 ℃；鞘氣流速11 mL/min；毛細(xì)管電壓3 000 V；去簇電壓180 V；負(fù)離子模式：ESI源；干燥器溫度320 ℃；干燥器流速8 mL/min；鞘氣溫度400 ℃；鞘氣流速11 mL/min；毛細(xì)管電壓3 500 V；去簇電壓150 V。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Mass Hunter Profinder B.06.00 SP1軟件（美國安捷倫公司）對Agilent 6545高分辨質(zhì)譜儀采集的超高溫滅菌乳和復(fù)原乳樣品的色譜峰進(jìn)行提取、保留時間校準(zhǔn)、峰對齊、標(biāo)準(zhǔn)化等預(yù)處理，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

使用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行化學(xué)計量學(xué)分析。將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入該軟件中，使用無監(jiān)督式主成分分析（principal component analysis，PCA）觀察超高溫滅菌乳和復(fù)原乳的區(qū)分情況，進(jìn)一步使用偏最小二乘方差判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）方法找到區(qū)分2 種乳的表征因子。

使用SPSS 21.0軟件對超高溫滅菌乳和復(fù)原乳中各表征因子的含量進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA），在95%的概率水平上（P＜0.05）進(jìn)行測試，得出差異顯著性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 正、負(fù)離子模式下超高溫滅菌乳和復(fù)原乳PCA結(jié)果

圖1 正、負(fù)離子模式下超高溫滅菌乳和復(fù)原乳的PCA結(jié)果圖Fig. 1 PCA plots of UHT and reconstituted milk in positive and negative ion modes

基于高分辨質(zhì)譜積分?jǐn)?shù)據(jù)，利用SIMCA-P 14.1軟件，對超高溫滅菌乳和復(fù)原乳2 種乳的積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行無監(jiān)督式PCA。由圖1可知：正離子模式下，主成分1和主成分2的累積貢獻(xiàn)率達(dá)0.726；負(fù)離子模式下，主成分1和主成分2的累積貢獻(xiàn)率達(dá)0.678。結(jié)果表明，通過無監(jiān)督式PCA，2 種乳得到很好地區(qū)分，證明通過2 種乳中的內(nèi)源性小分子物質(zhì)可以將其區(qū)分開。

2.2 正、負(fù)離子模式下超高溫滅菌乳和復(fù)原乳PLS-DA分析及差異性表征因子篩選

為了找出復(fù)原乳和超高溫滅菌乳中的差異性物質(zhì)，將不同質(zhì)荷比（m/z）下的各峰面積積分結(jié)果進(jìn)行PLSDA分析。由圖2可知，通過PLS-DA分析，2 種乳得到很好地區(qū)分。

通過變量投影重要性（variable importance，VIP）對區(qū)別2 種乳有重要貢獻(xiàn)的變量進(jìn)行篩選。一般來說，當(dāng)VIP值大于1時，說明該變量對分類有顯著貢獻(xiàn)。因此，提取VIP值大于1的m/z作為區(qū)分2 種乳的表征因子，其中正離子中篩選出7 種表征因子，m/z分別為568.567 5、162.113 3、114.066 9、102.127 6、228.197 0、158.154 4和338.343 9，負(fù)離子中篩選出的7 種表征因子，m/z分別為193.036 3、195.051 8、165.041 6、179.058 0、683.231 5、112.052 5和192.067 8，正、負(fù)離子模式下VIP結(jié)果如圖3～4所示。

圖2 正、負(fù)離子模式下超高溫滅菌乳和復(fù)原乳的PLS-DA分析圖Fig. 2 PLS-DA plots of UHT and reconstituted milk in positive and negative ion modes

圖3 正離子模式下VIP柱狀圖（a）及2 種乳的峰面積積分（b～h）Fig. 3 VIP (a) and peak area integral in UHT and reconstituted milk (b～h) in positive ion mode

圖4 負(fù)離子模式下VIP柱狀圖（a）及2 種乳的峰面積積分（b～h）Fig. 4 VIP (a) and peak area integral in UHT and reconstituted milk (b～h) in negative ion mode

表1 正、負(fù)離子模式下區(qū)分超高溫滅菌乳和復(fù)原乳的14 種表征因子的方差分析Table 1 Analysis of variance of 14 biomarkers between UHT and reconstituted milk

進(jìn)一步，利用SPSS 21.0軟件對以上篩選出的14 種表征因子進(jìn)行方差分析。由表1可知，篩選出的14 種表征因子在2 種乳中均有高度顯著性差異。因此，利用篩選出的14 種表征因子建立區(qū)分超高溫滅菌乳和復(fù)原乳的判別模型。

2.3 超高溫滅菌乳和復(fù)原乳PLS-DA判別模型構(gòu)建

根據(jù)上述篩選出的14 種表征因子，建立PLS-DA判別模型。一般來說，評價PLS-DA模型擬合效果的指標(biāo)主要為R2x、R2y和Q2y，這3 個指標(biāo)越接近1，則代表該模型的擬合效果越好，而Q2y可以用于評價模型預(yù)測能力，Q2y越大，模型預(yù)測效果越好[22]。由圖5可知，本研究構(gòu)建的PLS-DA模型，R2x=0.765，R2y=0.934，Q2y=0.893，證明該模型的擬合效果較好，可以很好地判別超高溫滅菌乳和復(fù)原乳。

圖5 超高溫滅菌乳和復(fù)原乳的二維、三維PLS-DA模型及模型置換驗證結(jié)果圖Fig. 5 2D and 3D PLS-DA models and permutation plot of UHT and reconstituted milk

為了驗證模型的有效性，對模型進(jìn)行置換驗證，以避免該PLS-DA模型的過擬合。置換驗證結(jié)果見圖5C。LC-MS檢測獲得的數(shù)據(jù)陣經(jīng)過999 次建模獲得的R2y與真實模型的R2y共同構(gòu)成的回歸線截距為0.073 2，經(jīng)過999 次建模獲得的Q2y與真實模型的Q2y共同構(gòu)成的回歸線截距為-0.609 0。理論上，建模獲得的Q2y與真實模型的Q2y共同構(gòu)成的回歸線截距不大于0.05，證明所建的判別模型未過度擬合，統(tǒng)計學(xué)意義顯著[23]。因此，該模型未過度擬合，具有有效性。

3 結(jié) 論

由于超高溫滅菌乳和復(fù)原乳加熱殺菌溫度相差不大，且部分乳制品企業(yè)對牛乳加熱殺菌溫度控制不嚴(yán)格，容易使超高溫滅菌乳產(chǎn)生過熱加工[24]，增加復(fù)原乳與超高溫滅菌乳的判別難度。因此，目前對復(fù)原乳的研究主要集中于生乳、巴氏殺菌乳和復(fù)原乳的判別，然而對超高溫滅菌乳和復(fù)原乳判別方法的研究較少。本研究利用高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜儀，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法，采用非靶向代謝組學(xué)方法，建立一種區(qū)分超高溫滅菌乳和復(fù)原乳的判別模型，該方法既克服了傳統(tǒng)方法判別復(fù)原乳前處理復(fù)雜、耗時長等問題，又提供了一種判別超高溫滅菌乳和復(fù)原乳的方法，實現(xiàn)了對超高溫滅菌乳和復(fù)原乳的快速、高效判別，前處理簡單、可靠性高。

所得的14 種差異物質(zhì)有待后續(xù)通過采集二級碎片離子峰、匹配標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定性分析，以便為更好地找出復(fù)原乳和超高溫滅菌乳中的差異物質(zhì)打下基礎(chǔ)。