張云霞 曾莎芮 黃耀華 陳燦鈿 程東美 向梅梅

摘 ?要 ?在致病性測定的基礎上，通過形態(tài)特征觀察及基于特異性引物Pn1和Pn2擴增的DNA序列分析，對在廣州發(fā)現(xiàn)的白掌疫病的病原菌種類進行了鑒定。結(jié)果表明，引起廣州白掌疫病的病原菌為煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）。研究結(jié)果為白掌病害的防控提供了理論依據(jù)。

關鍵詞 ?白掌;疫病;特異引物;煙草疫霉

中圖分類號 ?S436.8 ?????文獻標識碼 ?A

Abstract ?A strain was isolated from the diseased plants of Spathiphyllum sp. from Guangzhou. The Pathogenicity test showed the isolated strain was the pathogenic fugus of Spathiphyllum blight. The pathogenic strain was identified according to the morphology， rDNA internal transcribed spacer sequencing amplified by Pn1和Pn2. The result showed Phytophthora blight of Spathiphyllum from Guangzhou was caused by Phytophthora nicotianae. The result would provide a foundation for effective control of the disease.

Keywords ?Spathiphyllum sp. ; Phytophthora blight; specific primer; Phytophthora nicotianae

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.019

白掌（Spathiphyllum spp.），又稱白鶴芋、苞葉芋，屬于天南星科（Acreare），白鶴芋屬（Spathiphyllum），為多年生草本植物。白掌原產(chǎn)于美洲，20世紀80年代末引入中國。因其花型獨特，有“一帆風順”寓意，廣受消費者喜愛。廣東是白掌的主產(chǎn)地，近年來，作為主要的小盆栽觀葉植物，白掌的種植面積逐年增加。

作者在白掌病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，廣州某生產(chǎn)基地大面積發(fā)生疫病，受害植株莖基部腐爛，死亡率高達50%以上。為明確該病害的病原菌種類，為病害的防控提供理論依據(jù)，本研究對其病原菌進行了鑒定。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試植株 ?病株樣品采自廣州某生產(chǎn)基地的大花白掌。接種植株為健康的大花白掌。

1.1.2 ??供試培養(yǎng)基 ?馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基用于菌株的分離培養(yǎng)和菌種的保存，馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)液用于接種菌絲的培養(yǎng)，水瓊脂（WA）培養(yǎng)基用于單菌絲分離，V8汁培養(yǎng)基用于疫霉孢子囊和卵孢子的誘導。

1.2 ?方法

1.2.1 ??病原菌的分離純化 ?采用組織分離法進行病原菌的分離[5]。具體方法如下：選取典型的病組織，自來水沖洗，晾干，于病健交界處切取3～5?mm2的若干小塊，依次于75%酒精消毒10～20?s、2.5%次氯酸鈉溶液消毒10～15?s、無菌水清洗3次;用無菌濾紙吸干組織塊表面的水分，將組織塊移至PDA平板上，每皿5塊，共6皿，于25?℃恒溫箱培養(yǎng)。

菌株的純化保存：待菌落長出后，挑取菌落邊緣的菌絲移至新的PDA平板上純化;將純化后的菌株移接至PDA斜面上培養(yǎng)，于13?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

單菌絲分離：挑取少量菌絲，接種于WA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)2～3 d后，在光學顯微鏡下切取單根菌絲，移植于PDA平板上，25?℃培養(yǎng)。

1.2.2 ?致病性測定 ?采用灌根法接種：選取長勢一致的健壯幼苗，扒開表層土壤，用PD培養(yǎng)液震蕩培養(yǎng)3?d的菌絲懸浮液灌根，再用基質(zhì)覆蓋表層，并套袋保濕，以無菌水灌根為對照，每個處理3次重復。接種植株置于25～28?℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)，觀察記錄發(fā)病情況。

病原菌的再分離：采用常規(guī)組織分離法對接種發(fā)病植株的病組織進行再分離，并通過菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察確定分離菌株是否與接種菌株一致。

1.2.3 ?病原菌形態(tài)鑒定 ?菌落特征觀察：PDA平板上27?℃培養(yǎng)5 d后，在菌落邊緣用無菌打孔器切取菌餅，移接至新的PDA平板上，菌絲面向下，27?℃培養(yǎng)，于2、4、6、8 d觀察并記錄菌落特征，測量菌落直徑，計算生長速率[6]。

顯微形態(tài)特征觀察：V8汁平板上培養(yǎng)5 d后，在菌落邊緣用無菌打孔器切取菌餅，將菌餅移入無菌培養(yǎng)皿中，每皿5塊，菌絲面向上，倒入無菌水至剛好沒過菌絲塊，25?℃培養(yǎng)2?d，觀察孢子囊及卵孢子形態(tài)并測量大小，孢子囊及卵孢子各測30個[6]。

1.2.4 ?病原菌分子鑒定 ?真菌基因組DNA的提?。簡尉z菌株于PDA平板上培養(yǎng)3～5 d后，收集菌絲，參照Chi[7]的方法提取DNA。

PCR擴增：分別用ITS的通用引物ITS1和ITS4[8]及煙草疫霉的特異引物Pn1和Pn2[9]進行擴增。PCR反應程序為：94?℃預熱5 min;94?℃變性30 s，56?℃退火45 s，72?℃延伸1?min，循環(huán)30次;72?℃終延伸10 min，4?℃保存。

DNA序列比對分析：PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，送至英濰捷基生物有限公司測序，測序結(jié)果輸入NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進行同源性比對。

系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：從NCBI網(wǎng)上下載可信度高的相關序列，用 MEGA 7軟件對實驗菌株及下載的序列進行比對分析，以Fusarium solani作為外群，通過ML法（Maximum Likehood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設1000次重復。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?白掌疫病的癥狀

病原菌沿根基部侵入，受害部位初期呈水漬狀，褐色，逐漸擴展至內(nèi)部;剖開病株假鱗莖，心芽變褐色，病變沿心芽向上擴展;受害植株最初表現(xiàn)葉片下垂、萎蔫，莖基部變褐濕腐，后期植株倒伏死亡。濕度大時，病害擴展迅速，病株幾天內(nèi)倒伏死亡（圖1）。

2.2 ?致病性測定結(jié)果

健康植株接種7?d左右，葉片開始變黃、下垂，莖基部逐漸變褐色，濕腐狀，并向上蔓延，14 d左右植株倒伏死亡（圖2）;剖開假鱗莖，內(nèi)部呈黑褐色腐爛，與田間癥狀一致。取接種發(fā)病植株進行組織分離，得到的菌株的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)與接種菌株基本一致，說明分離菌株為白掌疫病的病原菌。

2.3 ?病原菌的培養(yǎng)性狀及顯微形態(tài)

菌落白色，絮狀，邊緣整齊，初期菌絲稀疏，后期較致密（圖3A），平均生長速度10?mm/d。孢子囊無色，倒梨形，頂生，具有明顯乳突，大小為（21.60～41.06）μm × （13.06～25.84）μm（av. = 31.57 μm × 22.11?μm）（圖3B）。卵孢子淺褐色，近圓形，大小為22.84～38.48 μm（av. = 28.44 μm）（圖3C）。厚垣孢子少，多間生。

2.4 ?病原菌的分子鑒定

用真菌通用引物ITS1和ITS4對白掌疫霉病

A：受害植株癥狀;B：受害植株莖基部;C：受害植株莖基部內(nèi)部。

用ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示：實驗菌株（PYA1和PYA2）與Phytophthora nicotianae聚為一支，形成一個明顯的分支，表明親緣關系較近因此，結(jié)合形態(tài)學特征，將該病原菌鑒定為Phytophthora nicotianae。編號PYA1和PYA2分別為實驗菌株ITS1/ITS4和特異引物Pn1/Pn2擴增出來的2個序列，其他為NCBI上下載的可信度高的菌株序列。

3 ?討論

本文在致病性測定的基礎上，通過形態(tài)特征觀察及基于特異性引物Pn1和Pn2擴增的ITS序列分析，對在廣州發(fā)現(xiàn)的白掌疫病的病原菌種類進行了鑒定，明確引起廣州某生產(chǎn)基地白掌疫病的病原菌為Pythophthora nicotianae。

參考文獻

姜子德， 戚佩坤. 匙葉天南星褐腐病的檢出[J]. 植物病理學報， 1997， 27（1）： 71-74.

Uchida J Y. Foliar blight of Spathyphyllum caused by Phytophthora[Z]. Honolulu （HI）： University of Hawaii， 1989.

Uchida J Y. Pythium Root Rot of Spathiphyllum [Z]. Honolulu （HI）： University of Hawaii， 1990.

鄭曉慧， 戚佩坤， 姜子德. 廣州地區(qū)天南星科觀賞植物上的幾種新真菌病害-II[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報， 2001， 22（2）： 39-41.

方中達. 植病研究法[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版， 1998.

王潔菲. 花椒疫霉菌（Phytophthora spp.）鑒定及其拮抗菌篩選[D]. 陜西： 西北農(nóng)林科技大學， 2014.

Chi M H， Park S Y， Lee Y H. A quick and safe method for fungal DNA extraction[J]. The Plant Pathology Journal， 2009， 25（1）： 108-111.

White T J， Bruns T S， Lee J T. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]// Ma Innis， Gelfand D H， Sninsky J J， et al. PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications. New York： Academic Press， 1990： 315-322.

高喬分， 秦西云， 方敦煌， 等. 煙草疫霉的快速分子檢測[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學學報， 2012， 27（2）： 156-159.

Alfieri Jr S A ， Langdon K R， Wehlburg C， et al. Index of plant diseases in Florida （Revised）[Z]. Florida： Department of Agriculture and Consumer Services， Division of Plant Industries， 1984， 11： 1-389.

陳永強， 戚佩坤， 姜子德. 廣州地區(qū)九種花卉疫病病原種的鑒定[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報， 1998， 20（4）： 5-9.

鄭曉慧. 廣州地區(qū)天南星科觀賞植物真菌病害鑒定[D]. 廣州： 華南農(nóng)業(yè)大學， 1999.

Horinouchi H， Hagiwara H， Izutsu S， et al. Occurrence of Phytophthora rot of Spathiphyllum[J]. Annals of The Phytopathological Society of Japan， 1999， 65 （3）： 413-414.

畢可可. 匙葉天南星根莖腐爛病病原鑒定及生防菌株篩選[D]. 廣州： 華南農(nóng)業(yè)大學， 2009.

馬凱生. 廣州白掌主要土傳真菌病害鑒定及防治藥劑的篩選[D]. 廣州： 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院， 2015.