傅鈺 王苓 龍鴻

摘 ?要 ?高等植物生長(zhǎng)發(fā)育階段可分為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)2個(gè)階段，其中營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段中只有通過(guò)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變方可進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變（vegetative phase change，VPC）是植物從幼齡期（juvenile stage）到成熟期（adult phase）的轉(zhuǎn)變，受到基因表達(dá)的調(diào)控。生物鐘（circadian clock）相關(guān)基因LHY和CCA1單獨(dú)作用延遲VPC的發(fā)生，這2個(gè)基因的共同作用下VPC是否受到影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以擬南芥（Arabidopsis thaliana）為研究對(duì)象，通過(guò)形態(tài)和莖尖分生組織（shoot apical meristem，SAM）解剖結(jié)構(gòu)觀察及調(diào)控因子miR156和靶基因SPL3的表達(dá)變化，分析LHY和CCA1 2個(gè)基因在VPC過(guò)程中的作用。結(jié)果表明：雙突變體lhycca1生長(zhǎng)周期為15 d，蓮座葉第5片時(shí)（第10天）出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛，此時(shí)葉基角和葉長(zhǎng)寬比增大且莖尖分生組織凸起明顯，miR156和SPL3的表達(dá)水平在植物生長(zhǎng)發(fā)育階段呈負(fù)相關(guān)變化。而野生型生長(zhǎng)周期為20 d，蓮座葉第6片（第15天）時(shí)才出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛、葉長(zhǎng)寬、葉基角、SAM、miR156和SPL3的變化。這些結(jié)果說(shuō)明在LHY和CCA1的共同作用下，VPC提前發(fā)生，LHY和CCA1 2個(gè)基因參與VPC的調(diào)控。

關(guān)鍵詞 ?營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變;lhycca1;生物鐘;擬南芥

中圖分類號(hào) ?Q945 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?Developmental phase of higher plant is composed of two stages： vegetative growth and reproductive growth. Only after the phase transition through vegetative growth does plant go through further reproductive growth. The transition from the juvenile stage to the adult phase in plants is termed vegetative phase change （VPC）， which is regulated by genes. Circadian clock-related genes LHY and CCA1 delay the occurrence of VPC by oneself， but the combined effects of these genes on VPC are not clear. Here， a double mutant lhycca1 of Arabidopsis thaliana was used to investigate the characters of VPC through the observation of plant morphology and anatomical structure of shoot tip meristem （shoot apical meristem， SAM）. The expression of molecular regulatory factor miR156 and its target gene SPL3 in VPC were also analyzed. Our results showed that the growth cycle of the lhycca1 double mutant lasted for 15 d. The onset of abaxial trichomes was on the fifth rosette leaf （the 10th day）. Meanwhile， the base angle and the length： width ratio of leaves increased dramatically， and the shoot tip meristem bulged obviously. During growth and development， the expression levels of miR156 and SPL3 was negatively correlated. By contrast， the growth cycle of the wild-type was about 20 d， with the changes of the abaxial trichomes， length： width ratio of leaves， leaf base angle， SAM， miR156 and SPL3 on the sixth rosette leaf （the 15th day）. These results indicated that VPC in the lhycca1 double mutant occurred in advance under the combined effects of the two genes. LHY and CCA1 genes regulated VPC to some extent.

Keywords ?vegetative phase change; lhycca1; circadian clock; Arabidopsis thaliana

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.008

高等植物的生命周期經(jīng)歷一系列不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段，其中會(huì)經(jīng)歷營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段和生殖生長(zhǎng)階段。大多數(shù)高等植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)階段通常以花芽的分化作為界限，通常一年生植物（擬南芥）在此過(guò)渡階段形態(tài)上變化較不明顯[1]。其中營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段又分為幼齡期（juvenile stage）和成熟期（adult phase），從幼齡期到成熟期的轉(zhuǎn)變稱為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變（vegetative phase change，VPC）[2]。

一年生擬南芥通常作為研究VPC過(guò)程的模式植物，VPC過(guò)程會(huì)伴隨其形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及分子層面上的變化。形態(tài)學(xué)的研究已經(jīng)表明，擬南芥植株幼年期葉片呈圓形，葉邊緣光滑，只生長(zhǎng)近軸面表皮毛;植株成熟期葉片呈匙形，葉邊緣呈鋸齒狀，生長(zhǎng)近軸面表皮毛和遠(yuǎn)軸面表皮毛，其發(fā)生VPC的標(biāo)志即出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛[3-4]。而細(xì)胞學(xué)上的標(biāo)志以莖尖分生組織（shoot apical meristem， SAM）生長(zhǎng)錐從平坦到凸起的變化[5]。分子研究表明，小分子RNA—miR156，及SPLs（SQUAMOSA promoter binding protein-like）基因家族中的靶基因SPL3在VPC中起重要作用[6]，miR156通過(guò)抑制SPLs基因家族中靶基因SPL3的表達(dá)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)自身表達(dá)，VPC的變化與miR156和SPL3表達(dá)水平的變化密切相關(guān)[7]，且研究結(jié)果顯示，在植物生長(zhǎng)發(fā)育階段，miR156幼齡期高水平表達(dá)，進(jìn)入成熟期其表達(dá)量大幅度下降，而靶基因SPL3表達(dá)模式則與miR156相反[8-9]，因而miR156通過(guò)對(duì)SPL3基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)VPC。

VPC與植物自身生物鐘密切相關(guān)。生物鐘是生物體內(nèi)周而復(fù)始的節(jié)律，常見(jiàn)為近似24 h的生物節(jié)律鐘[10]。其中CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1?（CCA1），LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）， 和TIMING OF CAB EXPRESSION 1?（TOC1）是擬南芥生物鐘相關(guān)基因，且構(gòu)成中央振蕩器的3個(gè)核心組成部分[11-12]，有研究發(fā)現(xiàn)，TOC1促進(jìn)LHY和CCA1的表達(dá)，而LHY和CCA1的結(jié)合抑制TOC1的表達(dá)[13]。前期本課題組研究結(jié)果表明[14]，生物鐘相關(guān)基因LHY和CCA1單一缺失突變體均在第7片蓮座葉（第16天）出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛、莖尖分生組織生長(zhǎng)錐出現(xiàn)明顯凸起以及發(fā)生miR156明顯下降的結(jié)果，均說(shuō)明生物鐘相關(guān)基因LHY和CCA1單一突變體對(duì)VPC起延遲作用。那么，兩基因共同缺失對(duì)VPC的影響值得進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)觀察lhycca1雙突變體植株生長(zhǎng)發(fā)育各階段的形態(tài)學(xué)變化、莖尖分生組織以及對(duì)miR156和SPL3的表達(dá)變化，探究了生物鐘相關(guān)基因?qū)M南芥VPC的影響，為深入研究生物鐘相關(guān)基因?qū)PC的調(diào)節(jié)機(jī)制提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

本研究所用的擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型（WT）種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。

擬南芥生物鐘相關(guān)基因雙突變體lhycca1的種子購(gòu)自美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)種子中心庫(kù)（Arab idopsis Biological Resource Center，ABRC）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?種植 ?將在4?℃低溫處理3 d的種子均勻點(diǎn)種在濕潤(rùn)的人工土[蛭石與大漢土體積比=1∶1混合，高溫（121?℃，30 min）滅菌]表面，貼好標(biāo)簽，覆上具有透氣孔的保鮮膜，放入人工培養(yǎng)室中，待子葉較大時(shí)揭膜。培養(yǎng)條件為22?℃，16?h光照，20?℃，8 h黑暗，相對(duì)濕度60 %，光照強(qiáng)度80～200 μmol/（cm2·s）。

1.2.2 ?形態(tài)學(xué)觀察 ?觀察野生型擬南芥及l(fā)hycca1雙突變體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。記錄其蓮座葉葉片總數(shù)、最早出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛的葉片數(shù)及葉片形態(tài)變化趨勢(shì);植物抽薹后，將全部蓮座葉摘取排列拍照，并使用DWRuler測(cè)量其葉片及葉柄之間形成的葉片基角。蓮座葉片長(zhǎng)與寬使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量，葉片長(zhǎng)為葉片頂端到葉柄與葉片連接處，葉片寬為葉片中最寬處，且用SPSS軟件對(duì)葉片長(zhǎng)寬比數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.3 ?石蠟切片的制作 ?擬南芥長(zhǎng)出真葉時(shí)，根據(jù)李和平[15]的方法，取不同生長(zhǎng)時(shí)期的野生型和雙突變體的植株于FAA固定液中固定24 h以上，用愛(ài)氏蘇木精整染3 d，梯度乙醇脫水，梯度二甲苯透明。浸蠟包埋后，用切片機(jī)LEICA RM2265切片，切片厚度9 ?m。中性樹(shù)脂封片后，于正置顯微鏡Olympus BX53下觀察，Spot Idea相機(jī)拍照，并保存。

1.2.4 ?熒光定量PCR對(duì)VPC相關(guān)基因進(jìn)行分析 ?使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（BIO-RAD CFX96）和大連寶生物熒光定量試劑（SYBR Premix Ex TaqTMⅡ）進(jìn)行檢測(cè)。

在熒光定量PCR中，提取野生型和雙突變體生長(zhǎng)發(fā)育階段各個(gè)時(shí)期的葉片組織中的RNA，且反轉(zhuǎn)成cDNA作為樣品模板，每個(gè)樣品重復(fù)3次，以Actin-2為內(nèi)參基因，對(duì)植株葉片中調(diào)控基因miR156和靶基因SPL3的表達(dá)進(jìn)行分析檢測(cè)。熒光定量PCR所用引物序列為：Actin-2-F： 5-GCTG

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?雙突變體的葉形觀察

觀察野生型和lhycca1雙突變體的葉形變化，進(jìn)而了解雙突變體對(duì)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變的影響特征。實(shí)驗(yàn)觀察到，野生型和雙突變體的第1對(duì)真葉分別出現(xiàn)在第7天和第6天，第2對(duì)真葉分別出現(xiàn)在第11天和第9天，第3對(duì)真葉分別出現(xiàn)在第15天和第13天。其中野生型在第20天時(shí)發(fā)生抽薹，但雙突變體在第15天時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)抽薹。根據(jù)圖2顯示，野生型蓮座葉葉片總數(shù)為15片，前5片葉形為近圓形，后期變?yōu)闈u長(zhǎng)的匙形（圖1A），葉片寬度變小，葉型伸長(zhǎng)，第6片（第15天）為遠(yuǎn)軸面表皮毛出現(xiàn)的葉序數(shù);雙突變體蓮座葉總數(shù)為7片，其中前4片接近圓形，后期葉片逐漸變?yōu)闈u長(zhǎng)匙形（圖1B），在第5片（第10天）葉片寬度開(kāi)始變小，葉緣出現(xiàn)鋸齒，且出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛。

結(jié)果表明，野生型和雙突變體分別在第6片和第5片時(shí)發(fā)生VPC，雙突變體的遠(yuǎn)軸面表皮毛和抽薹時(shí)間均早于野生型，說(shuō)明雙突變體VPC提前。

2.2 ?葉片基角的變化趨勢(shì)

植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，觀察葉片基角的變化，可觀察VPC發(fā)生時(shí)間。測(cè)量與統(tǒng)計(jì)野生型和雙突變體的葉片基角。雙突變體第3、4、5片蓮座葉葉基角分別為：111.35°、118.17°、128.83°，野生型第3、6、9片蓮座葉葉片基角分別為

A：野生型蓮座葉葉形;B：lhycca1雙突變體蓮座葉葉形。

106.38°、119.54°、127.34°。結(jié)果顯示，雙突變體的葉片基角均比野生型角度大，其中雙突變體的葉基角在第5片明顯增大，而野生型葉基角在第6片明顯增大。說(shuō)明雙突變體VPC比野生型發(fā)生時(shí)間提前。

2.3 ?雙突變體葉長(zhǎng)寬比的變化

由圖2可知，野生型和雙突變體前2片葉近似圓形，長(zhǎng)寬比比值接近于1，第3、4片葉長(zhǎng)寬比略增大，但比值基本相同;而野生型和雙突變體葉片長(zhǎng)寬比隨葉片數(shù)增多而逐漸增大，且分別在第6片和第5片葉長(zhǎng)寬比比值相比前一片蓮座葉極顯著增大（P<0.01）。因此，根據(jù)葉長(zhǎng)寬比分析，得到雙突變體VPC提前。

2.4 ?莖尖分生組織石蠟切片

野生型植株生長(zhǎng)第5天時(shí)（圖3A），SAM解剖結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，葉原基已生成，SAM生長(zhǎng)錐呈平坦?fàn)?，原套區(qū)域細(xì)胞為單層（圖3a）;WT植株生長(zhǎng)到第8天時(shí)（圖3B），生長(zhǎng)錐略有凸起，細(xì)胞為單層（圖3b）;第10天時(shí)（圖3C），SAM與第8天相比凸起略有升高（圖3c）;第13天時(shí)（圖3D），隨植株進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育，莖尖分生組織細(xì)胞增多，同時(shí)具有單層和多層細(xì)胞，但未進(jìn)入成熟期（圖3d）;第15天時(shí)（圖3E），生長(zhǎng)錐持續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育，凸起明顯增高，具多層原套細(xì)胞，原體和髓分生組織細(xì)胞分裂，數(shù)量增多（圖3e）;第20天時(shí)，花芽出現(xiàn)（圖3F），雄蕊原基出現(xiàn)（圖3f）。雙突變體lhycca1生長(zhǎng)第5天（圖3G）時(shí)，SAM生長(zhǎng)錐也呈平坦?fàn)睿?xì)胞未分化（圖3g）;第10天（圖3H）時(shí)，生長(zhǎng)錐較野生型凸起明顯，細(xì)胞分裂、增多（圖3h）;第13天（圖3I）時(shí)，生長(zhǎng)錐凸起十分明顯，原套細(xì)胞為多層，原體和髓分生組織細(xì)胞均分裂、增多（圖3i）;第15天時(shí)，已出現(xiàn)花芽（圖3J），出現(xiàn)典型的花原基（圖3j）。根據(jù)野生型和雙突變體莖尖分生組織生長(zhǎng)錐明顯凸起的時(shí)間對(duì)比發(fā)現(xiàn)，雙突變體VPC提前，與形態(tài)上觀察結(jié)果一致。

2.5 ?熒光定量PCR

在植株的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，野生型和雙突變體植株的miR156表達(dá)水平均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但雙突變體在各個(gè)發(fā)育階段的miR156表達(dá)量均比野生型低。從圖4可以看出，野生型在第15天時(shí)的miR156的表達(dá)量顯著低于第13天（P<0.05），說(shuō)明野生型在此時(shí)發(fā)生VPC，而雙突變體在第10天時(shí)相比于第8天時(shí)的miR156的表達(dá)量顯著降低（P<0.05），說(shuō)明雙突變體在此時(shí)發(fā)生VPC。結(jié)果表明雙突變體VPC發(fā)生的時(shí)間比野生型提前。對(duì)于SPL3的檢測(cè)結(jié)果表明，隨著植株的生長(zhǎng)發(fā)育，野生型和雙突變體的SPL3的表達(dá)水平均出現(xiàn)上升趨勢(shì)，但野生型均比雙突變體表達(dá)量高。從圖5可以看出，野生型第15天的SPL3表達(dá)量顯著高于第13天時(shí)的表達(dá)量（P<0.05），雙突變體在第10天時(shí)的SPL3表達(dá)量顯著高于第8天的表達(dá)量（P<0.05），說(shuō)明野生型和雙突變體VPC分別發(fā)生在第15天和第10天，與miR156所得出的結(jié)果一致，且與本研究中的其他結(jié)果一致。

3 ?討論

高等植物生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)歷營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)，其中營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期由幼齡期和成熟期組成，從幼齡期到成熟期過(guò)渡的重要轉(zhuǎn)變時(shí)期為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變，經(jīng)歷這一階段后，植株進(jìn)入生殖生長(zhǎng)[4]。如今對(duì)于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變的研究已有越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注，如Usami等[17]觀察蓮座葉葉形、遠(yuǎn)軸面表皮毛的出現(xiàn)等形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方面探究其VPC發(fā)生時(shí)間，因此在研究擬南芥VPC方面已有較為成熟的體系。前期本課題組[14]在單一生物節(jié)律鐘相關(guān)基因缺失對(duì)VPC的影響已有研究，而對(duì)于兩個(gè)生物節(jié)律鐘相關(guān)基因共同缺失對(duì)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變體制的影響尚缺乏詳盡的研究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究雙突變體lhycca1在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及基因表達(dá)3個(gè)方面，分析其對(duì)VPC的影響。結(jié)果表明，野生型和雙突變體分別在蓮座葉第6片（第15天）和蓮座葉第5片（第10天）出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛等形態(tài)上的變化，與野生型相比，雙突變體的VPC提前，而前期研究表明[14]各單一基因突變體均在蓮座葉第7片（第16天）發(fā)生形態(tài)變化，VPC均被延遲。說(shuō)明LHY和CCA1雙基因突變?cè)斐芍仓闢PC提前，單基因突變導(dǎo)致VPC發(fā)生延遲。為清楚了解野生型和雙突變體VPC變化特征，通過(guò)SAM的觀察得到，雙突變體SAM的原套、原體及髓分生組織提前發(fā)育，而前期結(jié)果中[14]各單一突變體其SAM發(fā)育遲緩。說(shuō)明LHY和CCA1共同作用下促進(jìn)SAM的發(fā)育，從而造成VPC提前，但單基因作用下，SAM發(fā)育延緩，延遲VPC的發(fā)生。且VPC的變化伴隨主要調(diào)控基因miR156及靶基因SPL3表達(dá)量的改變，從分子水平上證實(shí)雙突變體VPC提前，而前期[14] 對(duì)各單一基因突變體進(jìn)行miR156檢測(cè)發(fā)現(xiàn)VPC均被延遲。以上對(duì)其分析結(jié)果表明，生物節(jié)律鐘相關(guān)基因LHY和CCA1導(dǎo)致VPC發(fā)生變化，且兩基因作用下使VPC提前，而單基因作用下VPC被延遲。

因此在前期研究發(fā)現(xiàn)缺失LHY或CCA1單一基因延遲VPC發(fā)生的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步得到生物節(jié)律鐘相關(guān)基因LHY和CCA1同時(shí)缺失會(huì)造成VPC提前，促進(jìn)植株生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)程，且仍能保持自身生物鐘運(yùn)轉(zhuǎn)，說(shuō)明生物節(jié)律鐘相關(guān)基因LHY和CCA1參與調(diào)控VPC，是生物鐘核心振蕩器發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的核心組成部分。據(jù)此可以推測(cè)生物節(jié)律鐘相關(guān)基因LHY和CCA1在植株的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要調(diào)控作用。但其他生物節(jié)律鐘基因的雙重缺失是否會(huì)導(dǎo)致VPC以及生長(zhǎng)發(fā)育的改變，還玆待研究。

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