王朋寶，張晶晶，石菁，王威，曹智，張金文

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅農業(yè)大學農學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，甘肅 蘭州 730070)

油菜(Brassicanapus)屬十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)，是產油效率較高的油料作物，菜籽油產量占到我國油料作物總產油量的一半以上.栽培油菜主要分為白菜型、芥菜型和甘藍型3種，其中甘藍型油菜是全世界種植面積最廣，產量最大的油菜類型[1].它的籽粒中含有相當豐富的脂肪酸和蛋白質，生長過程需要大量的磷素供給，其供應正常與否對油菜的生長發(fā)育以及最終產量和品質都有很大影響[2,3].若磷素缺乏會導致其品質降低，產量大幅下降.前人研究發(fā)現(xiàn)，土壤中有效磷的含量越高，油菜各個器官中的含磷量也就越高，并且莖與葉的含磷量始終大于根[4].但是土壤中的有效磷含量非常低，大約在0.02%～0.2%之間[5]，絕大多數磷素都以有機態(tài)植酸形式存在，需要經過一系列轉化才能被作物直接吸收利用.農業(yè)生產中，雜草防治也是一項亟待解決的問題.雜草造成的直接經濟損失巨大，大約可以占到農作物總產值的1/5[6].我國50%～90%的油菜易發(fā)生草害，常年造成減產15%～20%，因此，防治草害對油菜生產有十分重要的意義[7].隨著社會經濟不斷發(fā)展，農業(yè)勞動力數量急劇下降及成本不斷上漲，致使傳統(tǒng)的人工除草已不能合理的跟上生產步伐，高效除草方法已經成為迫切需求.抗除草劑作物儼然是一種較佳選擇.張瑜等[8]成功從抗草甘膦油菜DNA中擴增得到EPSPS基因，以期用于油用亞麻抗除草劑的研究.May等[9]將CP4EPSPS基因導入‘珂字棉312’，驗證發(fā)現(xiàn)轉化植株產生了草甘膦抗性.萬麗麗等[10]構建了PCAMBIA-GOX-CP4EPSP植物雙元表達載體，利用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化甘藍型油菜并獲得轉基因植株，該轉基因株系可在噴施400倍農達的條件下存活.Mudge等[11]將植酸酶基因轉入擬南芥中，結果表明轉基因植株的磷素吸收效率和植物生物量顯著高于野生型.Hong等[12]用甘薯的貯藏蛋白啟動子在馬鈴薯中超表達具有酸性磷酸酶和植酸酶活性的基因，獲得的轉基因馬鈴薯植株可在以植酸作為唯一磷源時增加對磷的吸收.因此為同時解決甘藍型油菜生長過程中的草害及有效磷匱乏問題，本試驗構建了含有草甘膦抗性基因和植酸酶基因的雙價植物表達載體，并利用農桿菌介導法轉化甘藍型油菜，以期得到高效磷素吸收利用兼有草甘膦抗性的甘藍型油菜新材料，并為甘藍型油菜種質創(chuàng)新提供相關理論依據.

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗所用植物材料均為本實驗室保存的甘藍型油菜，主要包括新疆農科院自育自交系(‘新疆21109’)、‘隴油10號’恢復系C20(‘隴上東’)和‘青雜5號’恢復系(‘1831R’).

1.2 質粒和主要試劑

質粒pMD-nos(含nos終止子)、根癌農桿菌LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)以及植物表達載體pCEPSP(本實驗室用草甘膦抗性基因(EPSPS)替換pCMBIA1300中的潮霉素抗性基因(hyg)所得)均由甘肅農業(yè)大學省部共建干旱生境作物學重點實驗室植物代謝功能基因組學實驗室保存；質粒pTOPO-EPSPS(含CP4EPSPS基因)由甘肅省農科院張建平研究員饋贈，質粒PGA1611-E-PhpAO(含phyA基因)由中國農業(yè)科學院生物技術研究所陳茹梅研究員饋贈.PCR及qRT-PCR引物合成及DNA序列測定由蘇州金唯智生物科技(蘇州)有限公司完成；限制性內切酶、普通瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒均購自北京全式金生物(北京)技術有限公司；普通測序載體pMD19-T、T4 DNA連接酶、標準DNA Marker和高保真DNA酶(PrimeSTAR HSRDNA Ploy-merase)均購自；其他藥品試劑均是進口或國產分析純.

1.3 rbcS的生物信息學分析

登錄網站GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，檢索油菜Rubisco小亞基(rbcS)序列(ID：X07367.1).通過CBS Predition servers(http://www.cbs.dtu.dk/services)中的TargetP 1.1 Server和ChloroP 1.1 Server預測其亞細胞定位、編碼氨基酸序列中的轉運肽及其剪切位點.

1.4 引物設計

根據表達載體的酶切位點，并參照nos基因序列(ID：AF485783)、eCTP基因序列(ID：X07367.1)、EPSPS基因序列(ID:KJ701603.1)、Pht1;2基因序列(ID：AT5G43370)、phyA基因序列(ID：AF353576.1)和Actin2.1基因序列(ID：FJ529167.1)，采用Oligo7設計PCR擴增引物和qRT-PCR引物.

表1 引物序列

小寫部分為保護堿基，短下劃線部分為酶切位點，加粗部分為kozka序列，長下劃線互為重疊部分.

The lower case is the protectived base,the short underlined parts are the cleavage site，the bold part is the kozka sequence，and the long underline are the overlapping parts.

1.5 目的基因克隆

以質粒pMD-nos為模板，采用特異性引物對N1/N2亞克隆nos終止子；以甘藍型油菜RG2 cDNA為模板，采用特異性引物對C1/C2克隆葉綠體轉運肽eCTP；以質粒pTOPO-EPSPS為模板，采用特異性引物對E1/E2亞克隆EPSPS基因；以提取的野生型擬南芥DNA為模板，采用特異性引物對P1/P2克隆根特異性啟動子Pht1;2；以質粒PGA1611-E-PhpAO為模板，采用特異性引物對A1/A2亞克隆phyA基因；以回收的EPSPS基因和eCTP為模板，采用特異性引物對C1/E2，運用重疊PCR方法擴增融合片段L；利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，分別與pMD19-T連接，送至江蘇金唯智生物公司進行測序，分別將含有目的片段的正確重組子命名為pMD-nos、pMD-eCTP、pMD-EPSPS、pMD-Pht1;2、pMD-phyA、pMD-L.

1.6 植物表達載體構建

采用酶切連接的方法，依次在基礎載體pCEPSP中插入nos終止子、融合片段L、根特異性啟動子Pht1;2及植酸酶基因phyA，最終構建獲得了植物重組表達載體pC-NLTA(圖1)，并利用凍融轉化法將其整合到農桿菌LBA4404中，提取陽性菌落質粒，用特異性引物對P1/P2、C1/E2、A1/A2進行PCR鑒定，將陽性農桿菌工程菌保存，用于后續(xù)遺傳轉化.

圖1 表達載體示意圖Figure 1 Schematic representation of expression vectors

1.7 農桿菌介導的甘藍型油菜遺傳轉化及鑒定

以甘藍型油菜品種‘新疆21109’、‘隴上東’和‘1831R’無菌苗莖段為受體材料進行侵染.首先截取長約5～7 mm的無腋芽莖段，置于培養(yǎng)基上預培養(yǎng)2 d；使用培養(yǎng)至對數生長期(D600=0.5)的農桿菌工程菌侵染5～8 min后，擦干外植體外部多余菌液，接種到共培培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 d；隨后接種至脫菌培養(yǎng)基進行愈傷組織誘導和脫菌；4周后轉入分化培養(yǎng)基促進分化，3周后轉接至篩選培養(yǎng)基繼續(xù)誘導分化出芽；當芽長約2 cm時，切下轉入生根培養(yǎng)基誘導生根.最后，對成活的抗性植株進行分子檢測.試驗所用不同培養(yǎng)基的成分及配比見表2.

表2 甘藍型油菜遺傳轉化培養(yǎng)基

1.8 轉基因植株靶標基因轉錄水平檢測

采用實時定量PCR(qRT-PCR)檢測轉基因陽性植株中植酸酶基因phyA和草甘膦抗性基因EPSPS的表達.采用TRIzol法提取轉基因植株總RNA，用QuantScript RT Kit cDNA試劑盒合成cDNA第1鏈，將cDNA樣品稀釋8倍作為模板上機檢測，以油菜Actin2.1為內參基因(ID：FJ529167.1)，設3次重復，應用公式2-ΔΔCt計算在樣本處理前后的相對表達量，ΔΔCt=(ΔCt處理樣品-ΔCtActin2.1)-(ΔCt對照樣品-ΔCtActin2.1)[13].

2 結果與分析

2.1 rbcS的生物信息學分析結果

TargetP 1.1 Server分析結果見表3，結果顯示rbcS序列共編碼181個氨基酸，cTP、mTP、SP及other分數分別為0.737、0036、0.249和0.068.預測定位在葉綠體，可信程度為3，前序長度可能為54個氨基酸長度.ChloroP 1.1 Server分析結果見表4，結果顯示rbcS序列共編碼181個氨基酸，第二步網絡的輸出分數0.581，預測序列中含有轉運肽cTP，且建議切割位點評分為6.923，cTP長度為54個氨基酸長度.在此基礎上，再結合NCBI注釋，本試驗采用rbcSN端的77個氨基酸編碼序列為候選片段，堿基長度共231 bp，將其命名為eCTP.

表3 TargetP 1.1 Server分析結果

表4 ChloroP 1.1 Server分析結果

2.2 目的基因的克隆

分別以質粒pMD-nos、pTOPO-EPSPS和PGA1611-E-PhpAO為模板，特異性引物對N1/N2、E1/E2和A1/A2亞克隆得到了nos終止子(圖2-A)、EPSPS基因(圖2-C)和phyA基因(圖2-F)；分別以野生型擬南芥的DNA和甘藍型油菜RG2 cDNA為模板，特異性引物對P1/P2和C1/C2克隆得到了根特異性啟動子Pht1;2(圖2-E)和葉綠體轉運肽eCTP(圖2-B)；以回收的EPSPS基因和eCTP為模板，采用特異性引物對C1/E2，運用重疊PCR方法，得到了融合片段L(圖2-D)；以上各基因擴增片段大小均與預期相符，測序結果顯示與GenBank中注冊序列同源性較高.

M：DNA Marker；A/B/C/D/E/F-1、2、3：PCR產物M:DNA Marker；A/B/C/D/E/F-1，2，3:PCR products圖2 PCR擴增產物Figure 2 PCR amplification products

2.3 植物表達載體構建

利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，分別與pMD19-T連接，轉化DH5α感受態(tài)，挑菌抽提質粒，送至江蘇金唯智生物公司進行測序，分別將含有正確目的片段的重組子命名為pMD-NOS、pMD-eCTP、pMD-EPSPS、pMD-L、pMD-Pht1;2和pMD-phyA，再經PstⅠ和HindⅢ(圖3-A)、KpnⅠ和PstⅠ(圖3-B)、SacⅠ和HindⅢ(圖3-C)、XhoⅠ(圖3-D)、SacⅠ和SmaⅠ(圖3-E)、SmaⅠ和XbaⅠ(圖3-F)等限制性內切酶酶切后得到的片段大小與預期結果相符.

用HindⅢ和PstⅠ同時酶切pMD-NOS和載體pCEPSP，用T4連接酶連接，得到載體命名為pC-N，用HindⅢ和PstⅠ雙酶切檢測(圖4-A)，證明成功構建載體pC-N；用XhoⅠ同時酶切pMD-L和載體pC-N，回收目的條帶，用T4連接酶連接，得到載體命名為pC-NL，用XhoⅠ酶切檢測(圖4-B)，結果表明已成功構建載體pC-NL.用SacⅠ和SmaⅠ同時酶切pMD-Pht1;2和載體pC-NL，回收目的條帶，用T4連接酶連接，得到載體命名為pC-NLT，用SacⅠ和SmaⅠ雙酶切檢測(圖4-C)，證明成功構建了載體pC-NLT.用SmaⅠ和XbaⅠ同時酶切pMD-phyA和載體pC-NLT，回收目的條帶，用T4連接酶連接，得到載體命名為pC-NLTA，用SmaⅠ和XbaⅠ雙酶切檢測(圖4-D)，證明成功構建了pC-NLTA載體.

M：DNA Marker；A-1,2/B-1,2/C-1,2/D-1/E-1,2,3,4/F-1,2：酶切產物.M:DNA Marker；A-1,2/B-1,2/C-1,2/D-1/E-1,2,3,4/F-1,2:Restriction products.圖3 重組子雙酶切驗證Figure 3 Recombinant double enzyme digestion verification

M：DNA Marker；A-1：酶切產物；B-1/C-1/D-1：載體質粒；B-2、3/C-2、3/D-2、3：酶切產物.M:DNA Marker；A-1:digested product;B-1/C-1/D-1:vector plasmid;B-2,3/C-2，3/D-2，3:digested product.圖4 表達載體酶切驗證Figure 4 Expression vector digested verification

2.4 農桿菌工程菌的制備及鑒定

將表達載體pC-NTLA轉入農桿菌菌株LBA4404感受態(tài)細胞.提取質粒并用引物P1/P2、C1/E2和A1/A2進行PCR鑒定，目標條帶大小與預期一致，證明目標載體已成功轉入農桿菌.

2.5 甘藍型油菜轉化再生苗的獲得

用農桿菌介導法對3個甘藍型油菜品種進行遺傳轉化(圖5)，經草甘膦篩選，共獲得了共45株再生苗(‘1831R’ 20株；‘新疆21109’14株；‘隴上東’11株).提取再生植株的葉片DNA，以E1/E2引物對進行PCR擴增檢測，其中共有5株(‘1831R’2株；‘新疆21109’2株；‘隴上東’1株)能得到大小分別約為1 300 bp的特異片段，野生型植株則未出現(xiàn)(圖6)，說明外源基因已重組到轉化植株的DNA中.

2.6 轉基因植株靶標基因轉錄水平檢測

2.6.1 轉基因植株EPSPS基因轉錄水平檢測 在轉化植株中(圖7)，與對照(CK)相比，EPSPS基因的相對表達水平有顯著性差異，其相對表達量均呈顯著上調趨勢，在不同的株系中，上調水平有所不同，在‘1831R’中，EPSPS基因的表達水平分別為對照的2.0和2.1倍左右.‘隴上東’中，EPSPS基因的相對表達量為對照的1.9倍左右.‘新疆21109’中，EPSPS基因的相對表達量分別為對照的2.1和2.2倍左右.由此說明，外源EPSPS基因已經在轉化植株中成功表達.

A：預培養(yǎng)；B：農桿菌侵染及共培養(yǎng)；C：誘導的愈傷組織及草甘膦篩選；D：分化芽；E：生根誘導.A：pre-cultivation；B：agrobacterium infection and co-culture；C：induced callus and glyphosate screening；D：shoot regeneration；E：rootage induction.圖5 甘藍型油菜遺傳轉化過程Figure 5 Genetic transformation of Brassica napus

M：DNA Marker；1、2、3、4、5、6、7：轉基因陽性植株DNA的PCR檢測(EPSPS基因)；8：非轉基因植株DNA的PCR檢測；9：陽性對照(質粒pTOPO-EPSPS)；10：空白對照(水).M:DNA Marker;1,2,3,4,5,6,7:PCR detection of transgenic positive plant DNA (EPSPS gene);8:PCR detection of non-transgenic plant DNA;9:positive control (plasmid pTOPO-EPSPS);10:Blank control (water).圖6 轉基因陽性植株的PCR鑒定Figure 6 PCR identification of transgenic positive plants

2.6.2 轉基因植株phyA基因轉錄水平檢測 在轉化植株中(圖8)，與對照(CK)相比，phyA基因的相對表達量均呈顯著上調趨勢，在不同的株系中，上調水平有所不同，在‘1831R’中，phyA基因的表達水平分別為對照的1.67和1.49倍左右.‘隴上東’中，phyA基因的相對表達量為對照的1.76倍左右.‘新疆21109’中，phyA基因的相對表達量分別為對照的1.69和1.75倍左右.由此說明，外源phyA基因已經在轉化植株中成功表達.

*代表差異顯著或極顯著(*P<0.05、**P<0.01或***P<0.001).Asterisks indicate significent difference or extreme significent difference(*P<0.05、**P<0.01或***P<0.001)，Error bars indicate SD of three biological replicates eachwith three technical replicates.圖7 EPSPS基因在甘藍型油菜轉基因株系中的相對表達量Figure 7 Relative expression of EPSPS gene in transgenic strains of Brassica napus L.

*代表差異顯著或極顯著(*P<0.05、**P<0.01或***P<0.001).Asterisks indicate significent difference or extreme significent difference(*P<0.05、**P<0.01或***P<0.001)，Error bars indicate SD of three biological replicates eachwith three technical replicates.圖8 phyA基因在甘藍型油菜轉基因株系中的相對表達量Figure 8 Relative expression of phyA gene in transgenic strains of Brassica napus L.

3 討論

Klein等[14]在研究擬南芥和矮牽?；‥PSPS的葉綠體轉運肽時發(fā)現(xiàn)，它們都能將異源的EPSPS蛋白定位到葉綠體中.隨著基因工程技術發(fā)展突飛猛進，現(xiàn)在已經可以將葉綠體轉運肽與抗草甘膦的EPSPS基因融合，使其在植物中表達草甘膦抗性[15].鑒于轉運肽對EPSP合成酶前體進入葉綠體至關重要，所以本試驗運用生物學信息軟件分析并克隆了油菜葉綠體轉運肽eCTP，使之與來自CP4菌株的EPSPS基因融合，構建了含有融合基因的植物表達載體并轉化甘藍型油菜，以期獲得草甘膦抗性基因超表達的甘藍型油菜品種.而qRT-PCR結果顯示，EPSPS基因均在陽性植株中表達并較CK顯著上調了1.9～2.2倍.但是轉基因植株對草甘膦濃度的適應能力還需在后續(xù)試驗中進行驗證，檢驗陽性植株是否具有較高的草甘膦抗性.

為了提高作物對土壤中有機態(tài)磷的吸收利用，促進磷素資源的可持續(xù)利用，本試驗構建了由植物PHT1磷轉運蛋白家族中的AtPht1;2啟動子來驅動植酸酶基因表達的植物表達載體，通過農桿菌介導法來轉化甘藍型油菜，獲得轉基因陽性植株.qRT-PCR結果顯示，陽性植株與對照(CK)相比，phyA基因的相對表達量顯著上調了1.49～1.76倍.初步證明phyA基因已在轉基因陽性植株中表達，Richardson等[16]構建了由根毛特異性啟動子來驅動融合有信號肽的黑曲霉植酸酶基因phyA的表達載體，并將其轉入擬南芥中，結果發(fā)現(xiàn)轉基因植株中植酸酶會在信號肽的引導下被分泌到根外.在僅有植酸鹽為磷源的條件下，植株分泌的植酸酶會分解植酸鹽，釋放無機態(tài)磷(Pi)，供植株吸收利用.方小平等[17]將植酸酶基因轉入油菜品種‘中雙6號’中，結果發(fā)現(xiàn)轉基因植株能有效表達植酸酶基因，并且其能以植酸為唯一磷源正常生長，而非轉基因植株則不能.前人這些研究都與本試驗結果一致，但由于植酸酶活性受溫度、土壤pH等外界因素影響較大，仍需通過后續(xù)檢驗以確定植酸酶對于作物磷素高效吸收利用的影響.

本試驗中存在一定的不足之處，主要體現(xiàn)在假陽性較高和轉化效率較低兩方面，這導致后續(xù)試驗不能如期進行.油菜轉基因過程中，篩選劑的濃度至關重要，它影響著油菓轉化效率，過高的篩選劑濃度得不到足夠的轉化體個數，過低的篩選劑濃度會產生大量假陽性植株而起不到應有的篩選效果，后期工作量很大[18].本試驗假陽性較高可能是由于篩選劑(草甘膦)濃度較低或者篩選時間較短引起.后續(xù)實驗中可以通過增加篩選劑濃度或延長篩選時間來降低假陽性高的問題.關于轉化效率低的問題，回顧試驗，發(fā)現(xiàn)問題可能存在于預培養(yǎng)及侵染液濃度和侵染時間.關于預培養(yǎng)的問題，許本波等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)甘藍型黃籽油菜下胚軸的再生頻率，受預培養(yǎng)激素濃度的影響較大，下胚軸在轉入分化培養(yǎng)之前先進行一段時間的預培養(yǎng)，有利于提高分化效率，預培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L 2,4-D.而本試驗所用預培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D，這可能影響到下胚軸的分化效率.王景雪等[20]也認為同一品種，在不同的激素組合培養(yǎng)基上，油菜下胚軸分化頻率會有很大差異.農桿菌的侵染濃度以及時間對于轉化過程也是十分重要的，劉品等[21]在‘中油821’外植體分化研究中發(fā)現(xiàn)農桿菌濃度D600=0.4時，侵染5 min的外植體分化率最高.而本試驗采用的農桿菌工程菌濃度D600=0.5，侵染時間為10 min，這可能導致外植體愈傷效率下降，影響最終的轉化率.后續(xù)試驗中為達到高轉化率，需進行相應調整，篩選出適應于本試驗的高效轉化體系.

4 結論

綜上所述，本研究通過構建雙價基因表達載體并成功轉化甘藍型油菜，使其同時具有草甘膦抗性和高效磷素吸收利用的能力，為今后培育磷高效吸收利用兼具有草甘膦抗性的優(yōu)良甘藍型油菜新品種奠定基礎.