楊彬，金小青，李彩霞，焦揚(yáng)

(1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000)

茄子(SolanummelongenaL.)為茄科茄屬，別名落蘇、酪酥、昆侖瓜等，是為數(shù)不多的紫色蔬菜之一，也是一味中藥[1].茄子種植廣泛，價(jià)格低廉，取材容易，其花、果、莖、葉、根均可藥用，無毒、甘寒、具有活血散癖、消腫止痛、寬腸理氣之功效[2].太空茄子通過太空誘變及日光溫室加代選育后，再經(jīng)雜交選育，形成了具備高產(chǎn)、抗病性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)成分高等特點(diǎn)的新品種.而茄葉為茄子采收過程中下腳料之一，主要作為肥料或廢料處理，附加值較低.茄葉中富含多糖、龍葵堿、茄尼醇、咖啡酸、黃酮、揮發(fā)油、多酚等多種有效成分[3-7].黃酮作為茄葉中主要成分之一，具有抗炎、抗腫瘤、抗凝血、抑菌、防止心血管疾病、調(diào)節(jié)激素、防護(hù)、抗氧化、抗衰老作用[8-12]，因而具有較高的藥理及保健開發(fā)價(jià)值，已成為醫(yī)藥、食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).

周寶利等[13]采用有機(jī)溶劑提取茄子中總黃酮，并對(duì)不同品種黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定；李睿等[14]采用微波輔助提取茄子根中總黃酮；王治業(yè)等[15]對(duì)茄子皮中總黃酮提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化；安紅鋼等[16]對(duì)茄蒂中黃酮含量進(jìn)行測(cè)定并分析其對(duì)自由基的清除效果的影響；莫天錄等[17]對(duì)綠茄葉黃酮的純化工藝進(jìn)行了研究.綜上所述，目前茄子的副產(chǎn)品研究主要局限于茄子不同部位的研究，而關(guān)于太空茄子葉總黃酮方面的研究尚未見報(bào)道，為提高太空茄子采摘后的茄葉的附加值，對(duì)其黃酮提取工藝進(jìn)行分析，提高資源利用價(jià)值.本試驗(yàn)以太空茄子葉為研究材料，采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化太空茄子葉中總黃酮的提取工藝條件，利用HPLC確定其總黃酮的單體組成，為試材的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試材：太空茄子葉采摘于河西學(xué)院農(nóng)業(yè)試驗(yàn)園.

試劑：C2H5OH、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、Na2CO3等藥品為國(guó)產(chǎn)分析純；C2H3N、CH3OH、H3PO4為國(guó)產(chǎn)色譜純.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：100080-201610)、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：110773-201012)、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：100081-200907)均購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

河南省鞏義市英峪予華儀器廠生產(chǎn)的SHZ-2000型雙配套循環(huán)水式多用真空泵；上海棱光技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Spectrμmlab24分光光度計(jì)；國(guó)華電器有限公司生產(chǎn)的HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；AL204 Mettler Toledo公司生產(chǎn)的分析電子天平；美國(guó)PerkinElmer公司生產(chǎn)的2000Autosampler高效液相色譜儀.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 太空茄子葉的處理 茄子葉片清洗，陰干粉碎(60目)后利用石油醚(料液比1∶5)回流2.5 h，除去茄葉中的色素等物質(zhì)后，風(fēng)干備用.

1.3.2 太空茄子葉黃酮的提取

1.3.2.1 總黃酮提取 稱取0.5 g處理后的太空茄子葉粉末置于100 mL蒸餾瓶，不同料液比環(huán)境中，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，設(shè)置不同的溫度、時(shí)間回流提取，冷卻后真空抽濾，取濾液置于50 mL容量瓶，并用對(duì)應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇定容，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定總黃酮含量.

1.3.2.2 單因素試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取樣品0.50 g，在提取溫度為80 ℃、料液比1∶40(g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液、提取1.5 h的條件下，固定其他條件不變，各因素的水平梯度設(shè)置分別為提取時(shí)間1、1.5、2、2.5 h；料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70(g/mL)；提取溫度60、70、80、90 ℃；乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%；以總黃酮得率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3.2.3 太空茄子葉黃酮提取條件試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在其他條件固定的試驗(yàn)設(shè)置下，分別研究提取時(shí)間(X1)、料液比(X2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)對(duì)太空茄子葉黃酮提取效果的影響.單因素試驗(yàn)，用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1.

1.3.3 標(biāo)曲繪制和黃酮得率計(jì)算

1.3.3.1 測(cè)定波長(zhǎng) 將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液與稀釋30倍的回流提取液各0.5 mL、加0.3 mL 5%亞硝酸鈉混勻后反應(yīng)6 min、繼續(xù)加0.3 mL 10%硝酸鋁反應(yīng)6 min、再加入4.00 mL 4%氫氧化鈉顯色之后，用30%的乙醇定容至10 mL，在400～600 nm下得到黃酮的最大吸收波長(zhǎng).

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照高海寧等[18]的方法.稱取蘆丁20.0 mg，用少量75%乙醇溶解后移至100 mL容量瓶并定容，得到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，冷藏備用.取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL，分別置于10 mL容量瓶，加0.3 mL 5%亞硝酸納溶液搖勻后靜置6 min，然后加0.3 mL 10%硝酸鋁溶液搖勻后靜置6 min，再加入4.00 mL 4%氫氧化鈉，用30%的乙醇定容至刻度搖勻后靜置15 min.以空白試劑為對(duì)照，508 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程y=0.902 4x+0.005 4，R2=0.999 6.

1.3.3.3 太空茄子葉黃酮得率計(jì)算 按1.3.1.1方法提取太空茄子葉總黃酮，準(zhǔn)確吸取一定體積的濾液，按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程，求總黃酮得率.

式中，50是定容后濾液體積(mL)；v為加入反應(yīng)體系中的濾液體積(mL)；m為處理后稱取的茄葉粉末質(zhì)量(mg).

1.4 提取液中黃酮的定性鑒定

1.4.1 顯色反應(yīng) 取適量的樣品溶液，分別與氫氧化鈉溶液、硼酸溶液、三氯化鐵、乙酸鎂、鹽酸-鎂粉、三氯化鋁反應(yīng)，觀察顏色變化，并紫外燈照射，觀察熒光反應(yīng).

1.4.2 液相色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS2分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm).流動(dòng)相：A為乙腈溶液，B為0.1%的磷酸溶液，梯度洗脫程序?yàn)椋?～10 min，10%的乙腈；10～30 min，10%～30%的乙腈；30～60 min，30%～40%的乙腈；60～90 min，40%～70%的乙腈；90～130 min，70%～90%的乙腈；進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm.以標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間和樣品比較，確定樣品中存在的黃酮類成分.

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003數(shù)據(jù)處理，Origin 7.5軟件進(jìn)行作圖，圖中數(shù)據(jù)均為3次數(shù)據(jù)的平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤差，采用Design Expert 8.0軟件(ANOVA)進(jìn)行方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮的測(cè)定波長(zhǎng)

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液與太空茄子葉提取液顯色后在400～600 nm可見光區(qū)域掃描.結(jié)果表明，標(biāo)樣和樣液的最大吸收峰都在508 nm處，因此選擇508 nm作為太空茄子葉黃酮測(cè)定波長(zhǎng).

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 提取時(shí)間對(duì)太空茄子葉總黃酮得率的影響如圖1所示.太空茄子葉總黃酮得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，提取時(shí)間為1.5 h，總黃酮得率為最大值.由Fick擴(kuò)散定律可知[19]，在一定時(shí)間內(nèi)，總黃酮得率與提取時(shí)間呈正相關(guān)；當(dāng)提取時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，太空茄子葉中其他成分溶出量增多，導(dǎo)致總黃酮得率下降.因此，確定提取時(shí)間為1.5 h作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn).

圖1 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Figure 1 Effects of time on extraction yield of total flavonoids

2.2.2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 液比對(duì)太空茄葉總黃酮得率的影響見圖2.在其他條件不變的前提下，隨料液比的增大，總黃酮得率相應(yīng)升高，料液比為1∶40(g/mL)時(shí)，總黃酮得率最高；由于細(xì)胞內(nèi)和提取溶劑之間濃度梯度增加，傳質(zhì)效果增加[20]，得率不斷增加；當(dāng)料液比超過1∶40(g/mL)時(shí)，總黃酮得率下降；可能是由于太空茄葉中其他雜質(zhì)成分的溶解性增加，導(dǎo)致得率下降；因此，選擇料液比為1∶40(g/mL)為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn).

圖2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Figure 2 Effects of solid-to-liquid ratios on extraction yield of total flavonoids

2.2.3 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響 由圖3可知，總黃酮得率隨溫度的升高而升高，當(dāng)溫度高于80 ℃時(shí)，總黃酮得率上升趨勢(shì)比較緩慢，原因可能是溫度升高時(shí)，細(xì)胞間的碰撞加速使細(xì)胞破裂，總黃酮溶解速度加快；但總黃酮在較高溫度下，由于其穩(wěn)定性較差[21]，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，從而影響其得率；當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)，與提取溫度為90 ℃二者得率進(jìn)行比較，二者差異不顯著(P<0.05)，從節(jié)約能耗角度考慮，選擇80 ℃為提取最佳溫度.

圖3 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響Figure 3 Effects of temperatures on extraction yield of total flavonoids

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響 由圖4可知，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，太空茄子葉總黃酮得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，太空茄子葉總黃酮得率最高.可能是隨乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)增加，總黃酮極性和一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇極性相似；乙醇體積分?jǐn)?shù)過大時(shí)，茄子葉中醇溶性雜質(zhì)大量溶出，影響總黃酮溶出效果，導(dǎo)致總黃酮類物質(zhì)得率降低.因此，確定以80%體積分?jǐn)?shù)的乙醇為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn).

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響Figure 4 Effects of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

2.3 黃酮類化合物提取工藝回歸模型的建立及響應(yīng)面分析

2.3.1 回歸方程的建立 單因素試驗(yàn)，對(duì)影響太空茄子葉中總黃酮得率的主要因素提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比采用BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果見表2.

用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，得到太空茄子葉中總黃酮類化合物的提取率(Y)與提取時(shí)間(A)、料液比(B)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)各因素變量之間的函數(shù)關(guān)系：

Y=9.56+0.30A+0.18X2-0.39C-0.075AB-0.039AC-0.055BC+0.18A2-0.59B2- 1.08C2

為說明回歸方程的有效性以及各因素對(duì)總黃酮得率的影響程度，對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3.

從表3可以看出，模型P=0.002<0.01，說明此模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.111 6>0.05，不顯著，擬合程度較好.R2=0.936，說明93.6%可用此模型來解釋各因素與總黃酮得率之間的關(guān)系.C(乙醇體積分?jǐn)?shù))、C2(乙醇體積分?jǐn)?shù)二次項(xiàng))、B2(料液比二次項(xiàng))對(duì)太空茄子葉總黃酮得率達(dá)到極顯著水平；A(提取時(shí)間)對(duì)總黃酮類化合物提取率影響差異顯著(P<0.05)，其他項(xiàng)影響不顯著(P>0.05).

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 響應(yīng)面方差分析二次模型方差分析表(部分平方和- Ⅲ型)

**差異極顯著P<0.01;*差異顯著P<0.05.

**P<0.01；*P<0.05.

由F值表明，各因素對(duì)太空茄子葉總黃酮得率的影響順序由大到小依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>料液比.

2.3.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 從圖5分析可以看出，各因素的效應(yīng)值隨著自變量(試驗(yàn)因素)的變化為：隨著提取時(shí)間的單獨(dú)延長(zhǎng)，得率的變化趨勢(shì)是緩慢增加，其曲線較平緩，說明提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值影響不顯著；隨著料液比的單獨(dú)增加，提取率變化趨勢(shì)是先增加后下降，其曲線傾斜度大，表明料液比對(duì)響應(yīng)值影響顯著；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，提取率的變化趨勢(shì)是先增加后迅速下降，其曲線傾斜度較大，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮的提取率影響較大，對(duì)響應(yīng)值影響較大.

從圖6-A可以看出，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮得率先急劇增大，其變化曲度較陡峭，說明該因素對(duì)總黃酮提取影響較大，從響應(yīng)面和等高線可以看出，在提取時(shí)間為1.8 h時(shí)，料液比為1∶40時(shí)黃酮提取率最高.

圖5 單因素效應(yīng)與總黃酮提取率的關(guān)系圖Figure 5 Relations between single factor effect and total flavonoids extraction yield

從圖6-B可以看出，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，太空茄子葉中總黃酮得率先緩慢升高后迅速降低，其變化曲度較大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，總黃酮的提取率逐漸升高.從響應(yīng)面圖可知，提取時(shí)間為1.8 h時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時(shí)總黃酮提取率最高.

由圖6-C可知，隨料液比的升高，太空茄子葉中總黃酮得率先緩慢升高，后緩慢降低；相比而言，較乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)較大，說明對(duì)總黃酮得率的影響較大.從響應(yīng)面和等高線可以看出，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%總黃酮得率有最高響應(yīng)值.

圖6 逐因素交互作用對(duì)總黃酮得率的影響Figure 6 Effects of each eactor interaction on extraction yield of total flavonoids

2.3.3 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)和檢驗(yàn) 通過二次多項(xiàng)回歸的預(yù)測(cè)，得出太空茄子葉總黃酮提取的最佳條件為提取時(shí)間1.830 h、料液比1∶42.23(g∶mL)、提取溫度80 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)78%，此時(shí)的太空茄子葉總黃酮得率預(yù)測(cè)值為9.87%.結(jié)合現(xiàn)實(shí)的操作過程和便捷性，將其提取工藝參數(shù)修正為：提取時(shí)間1.8 h、料液比1∶42(g∶mL)、提取溫度80 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)78%，、測(cè)定得到總黃酮得率為9.82%.說明建立的模型與實(shí)際情況基本吻合.

2.4 提取液中黃酮的定性鑒定

2.4.1 顏色反應(yīng) 由表4可知，太空茄子葉黃酮提取液中確定含有黃酮類化合物，如黃酮醇，查爾酮異黃酮等.

表4 顏色反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 液相色譜 由圖7可知，在10.19 min出峰的是蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品；在11.27 min出峰的是阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品；在15.37 min出峰的是槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品；在19.36 min出峰的是山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品.由圖7與圖8對(duì)比可知，太空茄子葉黃酮中含有蘆丁、阿魏酸和槲皮素.此結(jié)論與羅慧玉等[22]采用HPLC確定杏花中阿魏酸、蘆丁和異槲皮苷方法一致.

圖7 黃酮標(biāo)準(zhǔn)品在326 nm 處的HPLC液相色譜圖Figure 7 HPLC chromatogram of favonoids standardd at 326 nm

圖8 太空茄葉總黃酮提取液在326 nm 處的HPLC 液相色譜圖Figure 8 HPLC chromatogram of favonoids extracts from space eggplant leaf at 326 nm

3 討論

植物活性物質(zhì)的提取，其過程中目標(biāo)產(chǎn)物的得率受料液比、材料粉碎度、浸提溫度和提取劑等多種因素的影響，在一定范圍內(nèi)目標(biāo)產(chǎn)物的得率隨著料液比的增加而增大，當(dāng)達(dá)到一定程度后得率不再增加，這是由于在特定條件下一定比例的溶劑已基本將其提取完全[23-24].響應(yīng)面優(yōu)化法通過對(duì)回歸方程的擬合度以及響應(yīng)面工藝回歸模型的建立，可方便地求出相應(yīng)于各因素水平的響應(yīng)值.采用HPLC初步定性分析了太空茄子葉總黃酮的組分，未對(duì)單一組分得率為目標(biāo)進(jìn)行分析研究，在后續(xù)試驗(yàn)中仍需進(jìn)一步完善.通過優(yōu)化太空茄子葉總黃酮的最佳工藝參數(shù)，為后續(xù)總黃酮及其單體組分分離提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)擴(kuò)大農(nóng)作物資源、食品、生物工程以及化工領(lǐng)域的綜合利用范圍，提高其附加值，具有很好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益.

4 結(jié)論

用響應(yīng)面法分析優(yōu)化太空茄子葉總黃酮的提取條件，經(jīng)優(yōu)化后的提取工藝可使太空茄子葉總黃酮提取率保持在9.82%以上的水平.通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析、優(yōu)化提取太空茄子葉總黃酮的最佳工藝條件為：提取時(shí)間1.8 h、料液比1∶42(g∶mL)、提取溫度80 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)78%，最佳總黃酮得率可達(dá)9.82%.同時(shí)得到太空茄子葉總黃酮得率與各提取條件的二次多項(xiàng)式模型，該模型擬合度較好.通過定性試驗(yàn)，其結(jié)果表明太空茄子葉黃酮提取物中含有多種黃酮類物質(zhì)；由液相色譜結(jié)果可知其中含有蘆丁、槲皮素、阿魏酸.