楊繼業(yè) ，高 佳 ，陳書明 ，劉 慈 ，張 林 ，姬翔宇 ，王 寧 ，衛(wèi) 陽 ，武怡荷

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省畜牧遺傳育種中心，山西太原030027）

紙層析是典型的分配層析，具有操作簡單、所需樣品量少、分辨率一般能達到要求等優(yōu)點，是氨基酸等生物小分子分離、鑒定常用的方法[1-3]。紙層析用濾紙作為支持物，以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，沿濾紙流動的有機溶劑為流動相，根據(jù)混合樣品中各組分在兩相中分配系數(shù)的不同，從而達到混合樣品中各組分快速、高效分離的目的[4-6]。如果將定量的各氨基酸樣品點在濾紙上，當(dāng)流動相沿濾紙經(jīng)過樣品時，樣品點上的氨基酸在水和有機相之間不斷進行分配。隨著流動相的移動，各種氨基酸按其各自的分配系數(shù)不斷得到分配，從而使各種氨基酸得到分離[7-10]。應(yīng)用紙層析法分離鑒定氨基酸是生物化學(xué)分析中常用的方法，也是生命科學(xué)、畜牧和獸醫(yī)等相關(guān)專業(yè)本科生教學(xué)大綱要求的必修實驗之一。

在科研過程中或本科生開展紙層析法分離鑒定氨基酸實驗過程中，由于班級及人數(shù)較多，實驗室空間有限，所以必須分組，各組在不同時間段完成實驗。在此過程中，發(fā)現(xiàn)靠后做實驗的小組出現(xiàn)氨基酸層析斑點擴散、分離效果差及Rf值減小等問題。究其原因可能是由于多次重復(fù)實驗過程中，層析溶劑（又稱展層溶劑）中部分有機溶劑揮發(fā)，使層析溶劑中有機溶劑與水的比例發(fā)生改變[11-14]，從而導(dǎo)致層析效果不理想。以往我們將使用5 d（或重復(fù)使用5次）后的層析溶劑倒掉，重新配制新溶劑。但這會引起實驗成本升高與環(huán)境污染問題。

本試驗在重復(fù)使用5次后的層析溶劑中，分別續(xù)加不同體積的正丁醇與80%甲酸混合液（體積比5∶1），然后與新配制的層析溶劑進行氨基酸紙層析對比試驗，以期解決層析溶劑多次重復(fù)使用后實驗效果差的問題。

1 材料和方法

1.1 材料

標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液：稱取賴氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg溶于10 mL 0.01 mol/L的HCl中，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液[15]。

混合氨基酸溶液：將上述4種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液等濃度混合，使各標(biāo)準(zhǔn)氨基酸質(zhì)量濃度達1mg/mL[15]。

展層溶劑：按正丁醇∶80%甲酸∶水=15∶3∶2（體積比）的比例配制300 mL，分別放入3個層析缸中，每個層析缸100 mL，并標(biāo)記為1號液、2號液和3號液。在學(xué)生重復(fù)使用5次后，待第6次實驗前，按照正丁醇∶80%甲酸＝5∶1（體積比）的比例配制混合液，取該混合液0，6，12 mL分別添加在上述1號液、2號液和3號液中；同時，按照正丁醇∶80%甲酸∶水＝15∶3∶2（體積比）再配制100 mL新層析溶劑放入另一層析缸內(nèi)，標(biāo)記為對照組，然后進行氨基酸紙層析對比試驗。

顯色劑：0.5%茚三酮乙醇溶液。

1.2 方法

1.2.1 層析濾紙的準(zhǔn)備 裁剪層析濾紙（18 cm×18 cm）12張，在濾紙頂部分別標(biāo)記對照組、1號液、2號液、3號液（每組設(shè)置3個重復(fù)），并在距濾紙下邊緣2cm處用鉛筆輕輕劃一條線，在線上每隔3cm畫一小圓點作為點氨基酸樣品的標(biāo)記[16]。

1.2.2 點樣 將準(zhǔn)備好的濾紙懸掛在點樣架上，濾紙垂直桌面，用潔凈毛細管（或裁剪了尖頭的牙簽）蘸取氨基酸樣品，與濾紙垂直方向輕輕碰觸點樣標(biāo)記點中心，使氨基酸樣品吸附在濾紙上，點樣點擴散直徑控制約2 mm，自然晾干（或冷風(fēng)吹干），再重復(fù)點第2次樣品，如此重復(fù)點樣3次[17-18]。對裁剪好的12張層析濾紙均用相同的方法進行點樣，點樣量以每種氨基酸含5～20 μg為宜，第3次點樣后，自然晾干（或冷風(fēng)吹干），再進行層析。

1.2.3 層析 在點好氨基酸樣品的濾紙頂端兩側(cè)，用2個拉有線繩的曲別針夾住，用雙手捏住線繩，將濾紙垂直放入標(biāo)記好的層析缸中（特別注意層析溶劑不能淹沒點樣線，濾紙上的溶劑浸濕線要與濾紙上的點樣線平行），蓋緊層析缸，進行層析。當(dāng)層析溶劑到達濾紙另一端的曲別針處時，取出層析濾紙，用吹風(fēng)機熱風(fēng)吹干，用鉛筆標(biāo)出溶劑前沿線，然后進行氨基酸顯色。

1.2.4 顯色 用顯色劑將層析濾紙溶劑前沿線下方區(qū)域噴濕，再用熱風(fēng)吹干，層析濾紙上即顯示出藍紫色斑點，然后測定各個氨基酸的比移值（Rf）[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和Duncan多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

4種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和混合氨基酸溶液的紙層析結(jié)果如圖1所示。在圖1中，混合氨基酸溶液分離出4 個斑點，分別為 AA1、AA2、AA3 和 AA4，點樣線上“賴”表示賴氨酸，“苯丙”表示苯丙氨酸，“丙”表示丙氨酸，“谷”表示谷氨酸。

由圖1可知，對照組中混合氨基酸的4個色斑均清晰可見，無明顯偏離以及拖尾現(xiàn)象，表明分離效果良好，符合試驗預(yù)期；而1號液組和2號液組中混合氨基酸色斑不清晰，且AA2和AA3有重疊現(xiàn)象，分離效果較差；3號液組中混合氨基酸的4個色斑較清晰，分離效果較好。

根據(jù)圖1的紙層析結(jié)果，可測量并計算出各氨基酸的Rf值，其結(jié)果列于表1。由表1可知，4種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中除苯丙氨酸外，其余3種氨基酸在1號液組和2號液組的Rf值均顯著低于對照組和3號液組（P＜0.05）；但對照組與3號液組相同氨基酸的Rf值差異均不顯著（P＞0.05）。此外，對照組和3號液組中混合氨基酸的Rf值均與4種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸Rf值差異不顯著（P＞0.05），表明混合氨基酸AA1為苯丙氨酸；AA2為丙氨酸；AA3為谷氨酸和AA4為賴氨酸。

上述試驗結(jié)果表明，在重復(fù)使用5次后的層析溶劑中補加正丁醇與80%甲酸（體積比為5∶1）混合液12 mL，再進行氨基酸紙層析試驗，對混合氨基酸分離效果良好，與新配制層析溶劑所得試驗結(jié)果差異不顯著。

表1 4種氨基酸和混合氨基酸溶液的Rf值

3 結(jié)論與討論

層析技術(shù)是一種根據(jù)混合物中各組分理化性質(zhì)的差異，使混合物得以分離的技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和生物科學(xué)等領(lǐng)域。依據(jù)原理不同，層析技術(shù)種類又可分為吸附層析、分配層析、分子篩層析、離子交換層析和親和層析等[8]。其中，紙層析法屬于分配層析，主要用于各種單糖、維生素和氨基酸等小分子化合物的分離鑒定。

在一定試驗條件下，每種氨基酸紙層析都有其固定的Rf值，Rf值是被分離氨基酸的特征性常數(shù)[20]。但隨著試驗條件的改變，氨基酸的Rf值也會發(fā)生改變。劉穎沙等[21]對紙層析法分離鑒定氨基酸試驗的層析溶劑進行了優(yōu)化，結(jié)果認(rèn)為，正丁醇、80%甲酸和水的體積比為15∶3∶2時，試驗效果最好。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)、動物醫(yī)學(xué)等很多本科專業(yè)都開設(shè)“紙層析法分離鑒定氨基酸”實驗，由于班級數(shù)以及實驗分組數(shù)很多，常會重復(fù)使用展層溶劑。而展層溶劑主要成分為正丁醇、甲酸和水，由于這3種成分沸點不同，揮發(fā)性能存在差異，所以長時間多次重復(fù)使用后，必然導(dǎo)致其中有機溶劑揮發(fā)較多，使展層溶劑中3種成分的比例發(fā)生改變，從而導(dǎo)致氨基酸Rf值發(fā)生改變，實驗效果變差。本研究根據(jù)氨基酸紙層析實驗原理及實驗現(xiàn)象，在重復(fù)使用多次的層析溶劑中加入不同體積正丁醇與80%甲酸（體積比5∶1）混合液，混勻，然后與新配制的層析溶劑進行氨基酸紙層析對比試驗，結(jié)果表明，在100 mL重復(fù)使用5次的層析溶劑中加入正丁醇與80%甲酸混合液12 mL，其試驗效果與用新配制層析溶劑所得試驗效果一致。結(jié)果表明，重復(fù)使用多次的層析溶劑可以不廢棄，只需添加一定量正丁醇與80%甲酸混合液即可繼續(xù)使用。這樣不僅節(jié)約了實驗成本，而且減少了實驗廢液的排放，既經(jīng)濟又環(huán)保。

氨基酸紙層析Rf值除了與氨基酸自身結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)外，還與展層溶劑等多因素有關(guān)。有研究表明[21]，氨基酸層析分離采用薄層板比采用濾紙分離效果更好。在紙層析法分離鑒定氨基酸實驗中，還應(yīng)注意幾點：試驗過程中應(yīng)保持層析濾紙干凈，盡量避免用手直接觸摸，帶一次性PE手套操作為好；點樣線（點）應(yīng)該用鉛筆畫，不能用油筆及中性筆，因為展層溶劑是含極性與非極性溶劑的兩相系統(tǒng)，能溶解油筆及中性筆的標(biāo)記；點樣斑點直徑以2 mm為宜，若點樣斑點過大，會造成層析斑點因擴散更大并彼此連在一起，而使氨基酸難以分離，點樣斑點小，點樣量少，達不到氨基酸顯示的靈敏度（可以用吹風(fēng)機冷風(fēng)將點樣斑點吹干后，再重復(fù)點樣2次，這樣既可以保障點樣斑點小，又能保障氨基酸顯色需要的點樣量）；點樣過程中，不能用吹風(fēng)機的熱風(fēng)吹，防止因溫度過高導(dǎo)致氨基酸與濾紙纖維緊密連接，造成氨基酸層析斑點拖尾而難以分離；展層時，應(yīng)注意展層溶劑不能淹沒點樣線，否則樣品會溶于展層溶劑中，造成實驗失敗，另外，層析濾紙要垂直，一個層析缸放多張層析濾紙時，不能相互靠在一起，否則相互影響，也會造成實驗失敗。