吉 濤，曹 晶，陸冰洋

（山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

雞傳染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是通過感染雞傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）而引起發(fā)病[1]，雞傳染性法氏囊病病毒在病毒學分類中屬于雙股雙階段RNA病毒[2]，可以對雛雞的免疫器官即法氏囊造成破壞，從而引起免疫抑制。雞傳染性法氏囊病造成禽類發(fā)病具有急性發(fā)病、高度接觸性感染等特征[3]。IBDV由A和B共2個RNA片段組成（A片段堿基長度大約為3.4 kb，其含有2個部分重疊的開放閱讀框（ORF）。其中，大的開放閱讀框（ORF）編碼vp2-vp4-vp3聚合蛋白，其分子質量為110 ku，然后斷裂成vp2、vp4、vp3 3種蛋白。vp2分子質量為48 ku；vp4分子質量為29 ku；vp3分子質量為33 ku[4-5]；小開放閱讀框（ORF）編碼病毒的非結構蛋白vp5。B片段堿基長度大約2.85 kb，編碼vp1，vp1分子質量為91 ku[6-9]）。vp3基因是雞傳染性法氏囊病病毒的一個主要結構蛋白，是病毒衣殼的主要構成成分，含有雞傳染性法氏囊病病毒的特異性抗原決定簇，該抗原決定簇具有線性依賴性的特性，也具有中和抗原表位，但數(shù)量不多，具有相當?shù)拿庖弑Ｗo力[10]。

近年來，隨著雞傳染性法氏囊病超強毒（Very virulent infectious bursaldisease virus，vvIBDV） 的出現(xiàn)，能夠使疫苗免疫失敗[11-13]，目前有效的防治手段有卵黃抗體[14]等，雞傳染性法氏囊病已經(jīng)成為能夠廣泛對世界性包括我國在內的養(yǎng)禽業(yè)造成經(jīng)濟損失的重要病原之一[15-18]。所以，對雞傳染性法氏囊病的防控與診治提出了更高的要求，對雞傳染性法氏囊病進行早期準確的診斷具有相當重要的意義和價值。

本研究利用PRC技術針對疑似IBD進行分子鑒定，并對IBDVvp3基因進行測序比對，分析研究地區(qū)IBDV的流行趨勢，旨在為IBD防治提供理論依據(jù)，為進一步建立高特異性鑒別診斷分子生物學方法提供條件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 某規(guī)?；u場雛雞群發(fā)病，病初精神沉郁，排白色水樣稀糞，脫水、虛弱、死亡。剖檢可見，法氏囊呈黃色膠胨樣水腫、黏膜上覆蓋纖維素性滲出物；腎腫脹，充滿白色尿酸鹽，脾臟及腺胃和肌胃交界處黏膜出血。無菌采集病料，1 mL PBS加肝臟研磨1 min，6 000 r/min離心，取上清，低溫保存。

1.1.2 主要試劑 鼠源反轉錄酶（M-MLV）和RNase inhibitor，DNA marker 和 PCR kit均購自TAKARA公司；Trizol購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank登錄的IBDVvp3基因，參考雞傳染性法氏囊病病毒序列，經(jīng)Primer5對vp3基因序列設計并合成了一對引物：F：5′-CGTTTCCCTCWCAATCCACG-3′；R：5′-CT CAAGGTCCTCATCAGAGAG-3′。

1.2.2 病毒RNA的提取及vp3的擴增 參照RNA常規(guī)提取方法，取1.1.1病毒上清液250 μL，加入Trizol 750 μL，劇烈振蕩 15 s混勻，靜置 5 min。加入150 μL氯仿振蕩30 s混勻，4℃離心機12 000 r/min離心5 min。取上清液加入500 μL的異丙醇，上下顛倒混勻，4℃離心機12 000 r/min離心20 min，棄去上清；抽取-20℃預冷75%DEPC乙醇1 mL加入沉淀中洗滌，4℃離心機12 000 r/min離心5 min，棄去液體；虹吸，干燥沉淀，加20 μL DEPC水，水浴鍋中50℃水浴10 min，開始反轉錄。反轉錄體系為：1 μL random primer，10 μL RNA 模板和 4 μL dNTP，混勻后65℃水浴10 min，迅速取出放入冰浴 5 min，加入 1 μL M-MLV，4 μL 反應 Buffer和1 μLRNase inhibitor，37 ℃水浴 2 h。以反轉錄產物為模板，加入vp3特異引物進行PCR反應。PCR體系：dNTP 4 μL，PCR 反應 Buffer 5 μL，cDNA 模板5 μL，上游引物 2 μL，下游引物 2 μL ，DNA 聚合酶1 μL，Mg2+5 μL，ddH2O 26 μL，PCR 反應為 50 μL體系。擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性1 min；55℃退火1min，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產物送華大公司進行測序。

1.2.3vp3序列分析 根據(jù)vp3片段測序結果，利用DNAstar軟件對其核苷酸高變區(qū)序列及vp3堿基序列推導的氨基酸序列與GenBank中登錄的其他IBDV參考毒vp3片段進行比較分析。參考名稱（登錄號）為：IBD疫苗毒株CEF94（AF194428.1）；IBD中等毒力致弱毒株IZO-2512（JQ315171.1），B87（DQ906921.1）；IBD標準經(jīng)典強毒株Ⅱ型毒株OH（U30818.1），ORF's（Z21971.1），52/70（D00869.2）；IBD超強毒株韓國KSH（JQ315171.1），香港HK46（AF092943.1），日本 OKYM（D49706.1）；變異株 Variant E（AF133904.1）；經(jīng)典弱毒株 D78（AF499929.1），Cu-1（X16107.1）。

2 結果與分析

2.1 vp3擴增結果

提取雞傳染性法氏囊病肝臟研磨上清液中病毒RNA，經(jīng)反轉錄取得cDNA后，以雞傳染性法氏囊病病毒vp3特異引物進行PCR反應擴增，擴增產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可知，目的片段約831 bp（圖1），與預期大小相符。

2.2 IBDVvp3同源性分析

測序結果表明，IBDVvp3基因核苷酸長度為831 bp。使用DNAstar分析軟件將雞傳染性法氏囊病病毒vp3基因與國內外已報道的vp3基因核苷酸序列進行同源性比對，結果表明，雞傳染性法氏囊病病毒vp3核苷酸序列與香港超強毒株HK46（AF092943.1）和日本超強毒株 OKYM（D49706.1）的同源性最高，為98.9%與97.5%；與疫苗株CEF94（AF194428.1），Cu-1（X16107.1），經(jīng)典弱毒株 D78（AF499929.1）和 IZO-2512（JQ315171.1）同源性相近，分別為94.8%，94.8%，94.7%和94.7%；與中等毒力致弱株B87（DQ906921.1）和經(jīng)典強毒株52/70（D00869.2）同源性為94.4%和94.3%；與變異株Variant E（AF133904.1）同源性為 93.8%；與Ⅱ型毒株 OH（U30818.1）和 ORF's（Z21971.1）同源性最低，為 84.8%（圖 2）。

同時對IBDVvp3氨基酸序列進行同源性分析，結果表明，IBDVvp3氨基酸序列與日本超強毒株 OKYM（D49706.1） 和香港超強毒株 HK46（AF092943.1）的同源性較高，為96.9%和96.2%；與疫苗株 CEF94（AF194428.1）、弱毒株 Cu-1（X16107.1）、經(jīng)典弱毒株D78（AF499929.1）、中等毒力致弱株I ZO-2512（JQ315171.1）、中等毒力致弱株 B87（DQ906921.1）、標準經(jīng)典強毒株 52/70（D00869.2）、變異株Variant E（AF133904.1）同源性分別為94.7% ，94.7% ，94.7% ，94.3% ，93.9% ，93.1% 和91.2%；與Ⅱ型毒株 ORF's（Z21971.1）和 OH（U30818.1）同源性較低，為90.5%和88.9%。表明IBDVvp3在氨基酸水平上與超強毒株日本OKYM（D49706.1）和超強毒株香港 HK46（AF092943.1）關系密切（圖3）。

2.3 IBDVvp3遺傳進化分析

根據(jù)雞傳染性法氏囊病病毒vp3核苷酸序列與雞傳染性法氏囊病病毒參考毒株相應序列，使用DNAstar MegAlign構建基因進化樹進行分析，結果表明，所選取的雞傳染性法氏囊病病毒參考毒株和檢測陽性毒株分成兩大分支：血清Ⅰ型和血清Ⅱ型，其中，血清Ⅰ型由4個部分構成，血清Ⅱ型由2個部分構成；IBDVvp3與香港超強毒株和日本超強毒株親緣關系最近，與變異毒株Variant E和經(jīng)典強毒株52/70親緣關系次之，與雞傳染性法氏囊病病毒中等毒力毒株和弱毒毒株親緣關系最遠，但是和雞傳染性法氏囊病病毒超強毒株韓國KSH的親緣關系與中等毒力毒株和弱毒毒株親緣關系相仿（圖 4）。

3 結論與討論

本研究通過設計引物對IBDVvp3基因進行PCR擴增鑒定，擴增結果為831 bp，編碼277個氨基酸，與預期目標相符。將IBDVvp3基因序列測定結果與GenBank經(jīng)典參考毒株進行核苷酸和氨基酸比對分析，結果表明，IBDVvp3基因在核苷酸水平和氨基酸水平2個方面均與日本超強毒株和香港超強毒株同源性最高，分別為98.9%，97.5%和96.9%，96.2%，表明該病毒在分子水平上屬于IBDV。

我國對于雞傳染性法氏囊病一直采用疫苗注射預防為主的防治技術，由于雞傳染性法氏囊病超強毒株和強毒變異株的出現(xiàn)，雞傳染性法氏囊病病毒能夠突破和損壞禽類免疫系統(tǒng)，導致雞傳染性法氏囊病的免疫失敗屢次發(fā)生，給雞傳染性法氏囊病的防治及控制其他傳染病繼發(fā)感染帶來巨大的困難。本研究通過對山西地區(qū)雞傳染性法氏囊病病毒vp3基因進行分子鑒定，以期為傳染性法氏囊病的免疫防治方法提供相應參考。