胡 軍 ，付 麗 ，王亞茹 ，張 彬 ，劉艷紅 ，賈 棟 ，馬瑞燕

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801）

蓮草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）是全球入侵性雜草喜旱蓮子草的專食性天敵，其已在世界范圍內(nèi)用于防治該惡性雜草[1-2]。目前，生物防治是最有效的防治手段[3]。昆蟲通過觸角辨別不同的氣味實現(xiàn)定位寄主植物[4]，氣味分子通過自由擴散進(jìn)入昆蟲觸角淋巴液后，首先由氣味結(jié)合蛋白（OBP）將其運輸并穿過淋巴液，送達(dá)神經(jīng)突觸上的氣味受體（OR），OR在收到氣味分子后，產(chǎn)生神經(jīng)沖動，實現(xiàn)化學(xué)信號與電信號的轉(zhuǎn)換，并最終引起昆蟲吸引、取食、逃避等行為反應(yīng)[5-6]。因此，OBP能否攜帶特定的氣味物質(zhì)到達(dá)OR是昆蟲能否識別氣味分子的關(guān)鍵。

目前，已有多種昆蟲OBP參與識別植物揮發(fā)物被報道。其中，草地螟（Loxostege sticticalis）OBP2對植物揮發(fā)性物質(zhì)中含量最高的反式-2-依維派鈉、順式-3-己烯基乙酸鹽有高的親和力和強的電生理反應(yīng)[7]；白背稻虱（Sogatella furcifera）OBP2、OBP11對水稻揮發(fā)物2-十三烷酮、β-紫羅蘭酮有高親和力[8]；苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）OBP10 對6種植物宿主揮發(fā)物月桂烯、β-蒎烯、β-紫羅蘭酮、3- 己酮、（E）-2- 己烯醛、1- 己醇有高的親和力[9]；中華蜜蜂（Apis cerana）OBP2、CSP3對花揮發(fā)物 β-紫羅蘭酮均有高親和力[10]；棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）OBP17、OBP18對多種植物揮發(fā)物尤其是β-紫羅蘭酮有高的親和力[11]；綠盲蝽（Apolygus lucorum）的 3 種 OBP（OBP3、OBP4、OBP6）和一種化學(xué)感受蛋白CSP1對植物揮發(fā)物沒有親和力，但對大部分次生代謝產(chǎn)物均有較高的親和力[12]；樟巢螟（Orthaga achatina）OBP2對植物揮發(fā)物法尼醇和法呢烯有高的親和力[13]；華北大黑鰓金龜?shù)?種OBP（OBP1、OBP2）均對植物揮發(fā)物有高的親和力[14]。

本試驗克隆蓮草直胸跳甲OBP51全長cDNA序列，分析其序列特征，并利用定量PCR分析其在成蟲不同組織中的相對表達(dá)量，旨在了解OBP51在蓮草直胸跳甲氣味識別過程中的作用，為進(jìn)一步揭示蓮草直胸跳甲專一取食喜旱蓮子草的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

蓮草直胸跳甲蟲源來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與生物防治實驗室長期飼養(yǎng)種群，在人工氣候箱中飼養(yǎng)完成，飼養(yǎng)溫度為25～27℃，光照條件為光照∶黑暗＝14 h∶10 h，濕度為85%。取食的喜旱蓮子草為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與生物防治實驗室溫室中常年種植。

PhusionRHigh-Fidelity DNA Polymerase購自NEB（伊普斯威奇，英國）；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega（麥迪遜，美國）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 OBP51全長基因克隆

表1 研究所用引物

取30頭化蛹3 d的蓮草直胸跳甲成蟲觸角，液氮研磨后用 TRIzol提取總 RNA；取 1 μg總RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用PhusionHigh-FidelityDNA Polymerase進(jìn)行全長序列擴增，PCR反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL，5×反應(yīng)緩沖液 4 μL，引物 OBP51-F/R（表 1）各 1 μL，dNTP 0.5 μL，DNA 聚合酶 0.2 μL，去離子水 12.3 μL。擴增程序為：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃20 s，35個循環(huán)；72℃5 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進(jìn)行切膠回收，連接到pEASY克隆載體后送至生工公司進(jìn)行測序。測序無誤的單克隆加甘油后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 OBP51序列分析

使用NCBI的ORF Finder進(jìn)行ORF預(yù)測，使用SignalP 5.0分析信號肽，使用COBALT進(jìn)行多序列比對，使用Compute pI/Mw計算等電點與分子量，使用ExPASy ProtParm進(jìn)行蛋白質(zhì)理化特性分析，使用PSIPRED預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)[15]；采用Mega 7.0的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中，boot strap為1 000次。

1.4 OBP51組織表達(dá)分析

取化蛹后3 d的蓮草直胸跳甲成蟲觸角、頭、胸、腹、后足、翅，分別提取總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser去基因組并反轉(zhuǎn)后保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｊ褂肁BI7500進(jìn)行定量PCR，體系（20 μL）為：2×TBGreenTMPremixExTaqTMII（Tli RNaseH Plus）10 μL，引物 OBP51-qF/qR（表 1）各1 μL，模板1μL。反應(yīng)條件為95℃3min；95℃30s，58℃30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。60～95℃進(jìn)行融解曲線分析。采用雙ΔCt法計算OBP51的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 OBP51基因克隆及分析

經(jīng)PCR擴增，電泳檢測，得到約400 bp的特異條帶，隨后克隆和測序，獲得OBP51的cDNA全長為 489 bp（圖 1），其中，5′UTR 34 bp，ORF 411 bp，3′UTR 44 bp，編碼 136 個氨基酸；經(jīng) Blast比對，其與多種其他昆蟲OBP均具有高的相似性，其中，與大紅葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a最高，為40.52%。初步確定該基因為氣味結(jié)合蛋白，并命名為AhygOBP51。

2.2 OBP51序列分析

信號肽分析表明，AhygOBP51含有18個氨基酸殘基的信號肽，成熟蛋白為118個氨基酸，分子量為13.06ku，等電點為4.83，為酸性蛋白。含有4個保守的半胱氨酸殘基，缺少Classic OBP特征模式C1X24-29C2X3C3X22-43C4X8-10C5X8C6中的C2和 C5，為 Minus-C 型 OBP。賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、谷氨酸（Glu）、蘇氨酸（Thr）含量均高于 10%，分別為11.9%，11.9%，11.0%和10.2%。不含精氨酸、色氨酸和酪氨酸。總平均疏水性-0.477，不穩(wěn)定系數(shù)40.52，脂肪族氨基酸指數(shù)74.41，表明AhygOBP51為脂溶性疏水蛋白，與氣味結(jié)合蛋白在觸角淋巴液的疏水環(huán)境是相符的。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，主要為α- 螺旋（helix），占 68.6%；其次為無規(guī)則卷曲，占28.8%。其符合氣味結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)特點。

2.3 OBP51多序列比對和進(jìn)化分析

將AhygOBP51與其他物種OBPs進(jìn)行多序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），除了含有4個保守的半胱氨酸殘基外，在C1與C3之間含有保守的苯丙氨酸（F），C4之后有更加保守的組氨酸（H），推測這些保守的氨基酸殘基可能與其定位或者運輸氣味分子的功能密切相關(guān)。

系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示（圖3），雖同為Minus-C型OBP，但被分為4個大分支，AhygOBP51與大紅葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a、56d、99a的進(jìn)化距離最近，與食糞金龜（Onthophagus taurus）OBP56d、大蠟螟（Galleria mellonella）OBP56d、葡萄花翅小卷蛾（Lobesia botrana）OBP44等位于同一大分支上。

2.4 OBP51表達(dá)分析

采用定量PCR對OBP51在成蟲不同組織的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（圖4），在觸角中高表達(dá)，在后足中也高表達(dá)，且雄蟲后足的表達(dá)量高于雌蟲后足。OBP51在不同組織中的表達(dá)量大小為觸角≈后足＞頭＞翅＞胸＞腹。在觸角和后足中的高表達(dá)提示，其除了參與觸角對氣味分子的識別外，可能還參與后足的其他功能。

3 結(jié)論與討論

蓮草直胸跳甲作為入侵性雜草喜旱蓮子草的專食性天敵，在該惡性雜草的生物防治過程中占有重要的地位。本研究克隆得到蓮草直胸跳甲的AhygOBP51，具有4個保守的半胱氨酸殘基，模式符合Minus-COBPs家族的典型特征。Blast分析顯示，編碼蛋白與大紅葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a相似性最高，為40.52%；系統(tǒng)進(jìn)化分析也表明，AhygOBP51與大紅葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a、56d、99a等聚為一支，表明其親緣關(guān)系較近，可能具有相似的功能。

OBP基因最早被發(fā)現(xiàn)特異性表達(dá)于家蠶觸角中[16]。后來更多的研究發(fā)現(xiàn)，OBPs主要在化學(xué)感受器官中表達(dá)[17]，在翅、足中也表達(dá)。除了觸角，其他組織中也分布有大量的味覺、嗅覺感器，推測可能參與昆蟲對寄主的定位[18-20]。組織表達(dá)分析顯示，AhygOBP51在后足、觸角中高表達(dá)，這可能與昆蟲能高效感受環(huán)境中各種氣味有關(guān)。除了觸角，OBP在足中高表達(dá)也在其他昆蟲中被發(fā)現(xiàn)，如茶尺蠖中多個OBP在足中高表達(dá)[21]；同樣的結(jié)果也在大草蛉[22]、松褐天牛[23]、茄無網(wǎng)蚜[24]中被發(fā)現(xiàn)，推測可能與感知寄主植物非揮發(fā)性物質(zhì)有關(guān)[25-28]，此推測有待進(jìn)一步證實。

本試驗成功克隆了蓮草直胸跳甲OBP51基因，并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析；熒光定量PCR分析顯示，該基因在觸角、足中高表達(dá)，揭示其在蓮草直胸跳甲的化學(xué)感知過程中具有重要功能。后續(xù)擬開展包括RNA干擾、熒光競爭結(jié)合試驗等工作深入研究其功能。