李 鳳，鄭汪東，唐文博

（山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同大學(xué)設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，山西大同037000）

谷子（Setaria italica）古稱粟，脫殼后即為小米，是禾本科黍族狗尾草屬1年生草本植物，為我國(guó)起源的特色作物。小米以其獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值成為廣大人民群眾喜愛的雜糧。我國(guó)是世界上谷子栽培面積最大的國(guó)家，在我國(guó)，谷子種植主要分布在北方各省的干旱、半干旱地區(qū)。谷子性喜高溫，生育適溫介于22～30℃，屬于抗逆穩(wěn)產(chǎn)作物，在植物抗逆機(jī)理研究方面具有獨(dú)特價(jià)值[1]。

干旱、鹽害及冷害等脅迫嚴(yán)重影響著我國(guó)北方作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。谷子經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇及不斷進(jìn)化，形成了完善的抗逆機(jī)制，成為挖掘抗逆基因的優(yōu)異種質(zhì)資源。近年來(lái)，人們對(duì)谷子的抗逆機(jī)制研究已取得了一定進(jìn)展，特別是谷子測(cè)序工作的完成，為谷子中抗逆基因的篩選和鑒定提供了可能，谷子也迅速發(fā)展成為功能基因組研究中新的候選模式作物[1]。通過(guò)從谷子自身分離挖掘抗逆基因，對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行抗逆分子育種，可以改良作物種質(zhì)資源。到目前為止，已有不少研究對(duì)谷子中的抗逆相關(guān)基因進(jìn)行了鑒定及功能研究[2-3]。

作為植物細(xì)胞膜脂的主要組成成分，不飽和脂肪酸能夠維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜的正常流動(dòng)，同時(shí)，不飽和脂肪酸參與著植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程以及應(yīng)答多種環(huán)境信號(hào)[4]。脂肪酸脫氫酶（fatty acid desaturases，F(xiàn)AD）是一類不飽和脂肪酸合成途徑的關(guān)鍵酶，能夠催化脂肪酸鏈的特定位置上脫氫形成雙鍵，產(chǎn)生不飽和脂肪酸[4]。根據(jù)酶的定位和輔因子需求不同，F(xiàn)AD分為可溶性FAD和膜結(jié)合FAD兩大類。其中，膜結(jié)合FAD存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和質(zhì)體膜上，能夠催化以結(jié)合脂形式存在的脂肪酸進(jìn)行脫氫反應(yīng)。該類酶在生物體中普遍存在，編碼該類酶的基因是一個(gè)高度多樣化的基因家族[5]。

已有不少研究表明，膜結(jié)合FAD基因能夠維持植株在逆境脅迫條件下的正常生長(zhǎng)。水稻Os－FAD8、大豆FAD3及FAD7能強(qiáng)烈響應(yīng)低溫脅迫的誘導(dǎo)[6-7]。擬南芥FAD2和FAD6與番茄LeFAD3的表達(dá)均能顯著提高幼苗的耐鹽性[8-9]。在轉(zhuǎn)基因煙草中，F(xiàn)AD7基因的超表達(dá)顯著提高了植株的抗寒性[10]。將高山離子芥中克隆出的FAD3基因轉(zhuǎn)到煙草中過(guò)表達(dá)，能明顯提高煙草抵抗冷害、干旱和鹽害的能力[11]。目前，膜結(jié)合脂肪酸脫氫酶已在多種植物例如擬南芥、大豆、水稻、棉花等進(jìn)行了鑒定及進(jìn)化分析，但在谷子上的研究尚未見報(bào)道。

本研究在谷子基因組測(cè)序完成的基礎(chǔ)上，首次對(duì)谷子膜結(jié)合FAD基因家族成員在全基因組水平上進(jìn)行鑒定及進(jìn)化分析，旨在為今后研究谷子膜結(jié)合FAD的功能及抗逆機(jī)制提供重要的理論依據(jù)，為農(nóng)作物抗逆育種提供一系列候選基因。

1 材料和方法

1.1 谷子膜結(jié)合FAD基因的檢索

從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)[12]中下載擬南芥FAD的氨基酸序列[13]；從Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)[14]中下載谷子的基因組序列[1]，以擬南芥膜結(jié)合FAD基因的蛋白序列作為探針（query），利用Blast P程序搜索谷子的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，之后用Pfam[15]和SMART[16]數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選基因進(jìn)行驗(yàn)證，篩選后的基因作為最終的膜結(jié)合FAD成員進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2 谷子膜結(jié)合FAD基因家族的進(jìn)化分析

利用Clustal X軟件[17]對(duì)擬南芥、水稻及谷子中所有的膜結(jié)合FAD成員進(jìn)行氨基酸序列聯(lián)配。利用Mega 7軟件[18]，采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。利用GSDS工具[19]對(duì)FAD基因成員的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)利用ProtParam軟件[20]進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 谷子膜結(jié)合FAD成員的染色體定位和基因復(fù)制分析

谷子中膜結(jié)合FAD成員的染色體位置信息從谷子基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，染色體分布圖采用MapInspect軟件進(jìn)行繪制。復(fù)制基因的判定方法依據(jù)前人的研究[21]，根據(jù)復(fù)制基因在染色體上的分布位置將其區(qū)分為串聯(lián)重復(fù)事件和片段重復(fù)事件。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子膜結(jié)合FAD基因的鑒定與注釋

本研究通過(guò)Blast P程序最終在谷子基因組中鑒定出9個(gè)膜結(jié)合FAD基因家族成員，并按照擬南芥和水稻中同源基因的名稱對(duì)所鑒定的谷子膜結(jié)合FAD基因進(jìn)行命名（表1）。通過(guò)對(duì)谷子膜結(jié)合FAD編碼的蛋白質(zhì)信息進(jìn)行分析可知，SiSLD2的氨基酸序列最長(zhǎng)，數(shù)目達(dá)到470個(gè)，而SiDSD1的氨基酸序列最短，數(shù)目?jī)H有325個(gè)；預(yù)測(cè)的分子量最高是 51.96 ku（SiSLD2），最低是 37.46 ku（SiDSD1）；等電點(diǎn)分布在 7.94（SiDSD1）～9.55（SiFAD2.2）。

表1 谷子膜結(jié)合FAD基因家族編碼的蛋白質(zhì)信息

2.2 谷子膜結(jié)合FAD基因家族的進(jìn)化分析

本研究用Mega 7軟件構(gòu)建擬南芥、水稻和谷子膜結(jié)合FAD的系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)前人研究將其劃分為4個(gè)不同的功能亞家族，分別為第一類脫氫酶（First）、鞘脂類脫氫酶（Sphingolipid）、Front-end脫氫酶（Front-end）和 ω 類脫氫酶（Omega）（圖 1），用于闡明膜結(jié)合FAD基因之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

第一類脫氫酶亞家族包括ADS基因編碼的Δ7脫氫酶和Δ9脫氫酶，這類脫氫酶的作用是在飽和?；溕弦氲谝粋€(gè)C＝C雙鍵[5]。在擬南芥中共鑒定出9個(gè)膜結(jié)合FAD基因?qū)儆谠搧喖易?，而在谷子和水稻中均未鑒定出屬于該亞家族的成員。

Front-end脫氫酶也稱羧基定向脫氫酶，包括SLD基因編碼的Δ8脫氫酶，該類脫氫酶能在已有的雙鍵和脂肪酸鏈羧基末端間形成雙鍵[5]。谷子膜結(jié)合FAD基因中有2個(gè)SLD成員屬于該亞家族，擬南芥中也有2個(gè)SLD，水稻中只有1個(gè)。

鞘脂類脫氫酶亞家族包含一類DSD基因編碼的Δ4脫氫酶[5]。在谷子、擬南芥和水稻中均只鑒定出1個(gè)DSD基因。

Omega類脫氫酶亞家族編碼Δ12脫氫酶和Δ15脫氫酶，它們是一類甲基定向脫氫酶，催化在已有雙鍵和脂肪酸鏈甲基末端之間形成雙鍵[22]。其中，Δ12脫氫酶由FAD2和FAD6基因編碼，Δ15脫氫酶由FAD3、FAD7和FAD8基因編碼。從所構(gòu)建的進(jìn)化樹可以看出（圖1），F(xiàn)AD2和FAD6基因處于不同的進(jìn)化分支上；在谷子、擬南芥和水稻中均僅鑒定出1個(gè)FAD6，而FAD2數(shù)目不相同，其中，谷子FAD2基因有2個(gè)，擬南芥中僅有1個(gè)，水稻中有3個(gè)。FAD3、FAD7和FAD8形成另一個(gè)進(jìn)化分支，包含3個(gè)谷子FAD，3個(gè)擬南芥FAD和4個(gè)水稻FAD。

2.3 谷子膜結(jié)合FAD基因的基因結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)對(duì)谷子膜結(jié)合FAD基因的外顯子及內(nèi)含子的分布發(fā)現(xiàn)（表2、圖2），各個(gè)亞家族成員的基因結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一定的保守性，并且這種保守性與其進(jìn)化關(guān)系相吻合。其中，2個(gè)FAD3成員均含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子；2個(gè)SLD基因都只有1個(gè)長(zhǎng)度相近的外顯子；1個(gè)FAD7成員和1個(gè)FAD6成員均含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子；2個(gè)FAD2成員中1個(gè)基因含有1個(gè)外顯子，另一個(gè)基因含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子；1個(gè)DSD基因含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。

表2 谷子膜結(jié)合FAD基因的進(jìn)化分類及基因結(jié)構(gòu)信息

2.4 谷子膜結(jié)合FAD染色體定位及其基因復(fù)制事件

表3 谷子膜結(jié)合FAD基因的染色體位置信息

通過(guò)搜索谷子基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究獲得了谷子膜結(jié)合FAD基因的染色體位置信息（表3），并以此繪制出膜結(jié)合FAD成員的染色體定位圖（圖3）。從圖3可以看出，9個(gè)膜結(jié)合FAD基因分散分布在谷子的8條染色體上，其中，第3條染色體上沒有膜結(jié)合FAD基因；第7條染色體上含有2個(gè)膜結(jié)合FAD基因；其他染色體上分別只有1個(gè)基因。通過(guò)分析基因復(fù)制發(fā)現(xiàn)，谷子FAD基因中僅有1對(duì)復(fù)制基因（SiFAD3.1/SiFAD3.2）。根據(jù)這對(duì)復(fù)制基因在染色體上的分布可知，該次復(fù)制事件屬于片段復(fù)制。

3 結(jié)論與討論

目前，膜結(jié)合FAD基因已在擬南芥、大豆[13]、水稻[23]、可可[24]、棉花[23-25]、黃瓜[26]、花生[27]、油菜[28]等植物中完成了全基因組水平上的鑒定及進(jìn)化分析。隨著谷子基因組數(shù)據(jù)的公布，本研究對(duì)谷子膜結(jié)合FAD基因家族進(jìn)行了分析，通過(guò)檢索，在谷子中共鑒定出9個(gè)膜結(jié)合FAD基因；通過(guò)利用擬南芥、水稻和谷子膜結(jié)合FAD基因的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，將膜結(jié)合FAD基因劃分成4個(gè)亞家族，并發(fā)現(xiàn)第一類脫氫酶亞家族的基因在谷子中發(fā)生了缺失。該結(jié)果暗示在植物的進(jìn)化過(guò)程中不僅伴隨著基因的擴(kuò)增，同時(shí)也存在基因的突變和缺失[29]。其他亞家族的谷子膜結(jié)合FAD基因的數(shù)目與擬南芥和水稻相比沒有明顯差異。

基因結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)可以在一定程度上反映該基因家族的進(jìn)化過(guò)程[30]。本研究中，膜結(jié)合FAD基因結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明，各個(gè)亞家族中外顯子及內(nèi)含子的數(shù)目表現(xiàn)出一定的保守，這種保守與其進(jìn)化關(guān)系相吻合。

基因復(fù)制被認(rèn)為是植物進(jìn)化的動(dòng)力[31]。本研究在谷子中僅發(fā)現(xiàn)了1對(duì)膜結(jié)合FAD復(fù)制基因SiFAD3.1/SiFAD3.2，且該次基因復(fù)制事件屬于片段復(fù)制。結(jié)果說(shuō)明在谷子中，膜結(jié)合FAD基因家族主要在Omega亞家族中發(fā)生了擴(kuò)增，并且該擴(kuò)增是由片段復(fù)制事件促成的。

綜上所述，本研究對(duì)谷子中的膜結(jié)合FAD基因在基因鑒定、進(jìn)化分類、基因動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)、基因擴(kuò)增等方面進(jìn)行了研究，一方面有利于闡明谷子膜結(jié)合FAD基因家族的分子進(jìn)化機(jī)制，同時(shí)也可為今后谷子抗逆境脅迫基因的篩選和鑒定提供理論基礎(chǔ)。