劉芹燕, 巫興東#, 陳 東, 李舒豐, 秦真程, 王 真, 譚寧華?
(1.中國(guó)藥科大學(xué),中藥學(xué)院中藥制藥系,天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京211198;2.揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司,北京102206)
蘇黃止咳膠囊是晁恩祥教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn),基于“風(fēng)咳” 理論,研發(fā)而成的,2008 年經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市的中藥6 類新藥,是目前唯一一個(gè)被批準(zhǔn)用來(lái)治療咳嗽變異型哮喘和感冒后咳嗽的中藥制劑。其處方由9 味中藥材組成,其中蜜炙麻黃、紫蘇葉為君藥;蟬蛻、地龍、五味子和炒牛蒡子為臣藥;蜜枇杷葉和前胡為佐藥;炒紫蘇子為使藥。
目前,對(duì)蘇黃止咳膠囊的研究多集中在其臨床應(yīng)用[1-2]和藥理活性方面[3-4]。其臨床上的安全性和有效性已得到證實(shí),動(dòng)物試驗(yàn)研究亦表明具有止咳、抗炎、平喘、祛痰及免疫調(diào)節(jié)的藥理作用[5]。蘇黃止咳膠囊中單味中藥化學(xué)成分及其生物活性研究較透徹,麻黃中的麻黃堿和偽麻黃堿具有平喘藥理作用[6];紫蘇葉中主要為紫蘇醛等揮發(fā)油成分,具有抗炎藥理作用[7],非揮發(fā)性成分主要為迷迭香酸和綠原酸,有抗炎作用[8-9],另外綠原酸有免疫調(diào)節(jié)作用[9];蟬蛻中多巴胺二聚體類成分具有抗炎藥理作用[10];地龍中次黃嘌呤和琥珀酸具有平喘藥理作用[11];五味子中主要為木脂素類成分,其中五味子甲素和五味子醇甲具有抗炎藥理作用[12];牛蒡子中的牛蒡苷和牛蒡子苷元具有止咳、抗炎藥理作用[13];枇杷葉中主要為熊果酸、齊墩果酸等三萜酸類成分,具有止咳、抗炎藥理作用[14];前胡中主要為白花前胡甲素,具有抗炎、平喘藥理作用[15-16];紫蘇子中的迷迭香酸具有抗炎活性[8]。
但是蘇黃止咳膠囊組方的系統(tǒng)化學(xué)成分的研究鮮有報(bào)道,質(zhì)量控制方面也僅限于對(duì)鹽酸麻黃堿和紫蘇醛的含有量測(cè)定[17-18],無(wú)法全面反映蘇黃止咳膠囊的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。前期課題組利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS) 對(duì)蘇黃止咳膠囊及其中間體的揮發(fā)油成分進(jìn)行系統(tǒng)分析[19],本研究利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS) 將對(duì)蘇黃止咳膠囊中的非揮發(fā)性成分進(jìn)行研究,以期為該藥今后的質(zhì)量控制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、功效闡明、臨床指導(dǎo)合理用藥和工藝優(yōu)化等提供更多的科學(xué)依據(jù)。
1.1 儀器 Waters 1 525 分析型HPLC、Waters-Xevo TQD液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Waters 公司);島津LC-MS-IT-TOF(日本島津公司);SI-234 型電子分析天平[丹佛儀器(北京)有限公司]; BP211D 分析天平 (德國(guó)Sartorius 公司);Grant XB-22 型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);EYELA OSB-2100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海泉杰儀器有限公司)。
1.2 試劑 新綠原酸 (7)、隱綠原酸 (9)、維采寧-2(11)、異鼠李素3-O-β-D-半乳糖苷(16)、羅漢松樹(shù)酯酚(21)、戈米辛D(27)、五味子醇乙(28)、當(dāng)歸酰戈米辛H(30)、戈米辛G(34)、五味子酯乙(41)、五味子酚(43)、苯甲酰戈米辛O(49) 購(gòu)自南京元寶峰醫(yī)藥科技有限公司;檸檬酸(1)、腺苷(2)、鹽酸麻黃堿(4)、鹽酸偽麻黃堿(5)、夏佛塔苷(13)、4,5-二咖啡??鼘幩幔?8)、白花前胡甲素(37) 購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。綠原酸(8)、迷迭香酸(17)、牛蒡苷(20)、牛蒡子苷元(24)、五味子醇甲(26)、五味子酯甲(40)、五味子甲素(45)、五味子乙素(47) 為實(shí)驗(yàn)室分離提取得到,經(jīng)HPLC 檢測(cè),所有對(duì)照品含有量均≥95%。乙腈(色譜純,德國(guó)Merck 公司);甲醇(色譜純,上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?;甲酸[分析純,賽默飛世爾科技(中國(guó)) 有限公司];水(純凈水,娃哈哈集團(tuán)有限公司);蘇黃止咳膠囊由揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司提供。
2.1 樣品溶液制備 取膠囊3 粒,除去膠囊殼,研細(xì)混勻,取研磨后的粉末約1.0 g,精密稱定,置50 mL 錐形瓶中,加甲醇40 mL,室溫下超聲提取30 min,取出冷卻至室溫,加甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量,搖勻,靜置后過(guò)濾,殘?jiān)B同濾紙用甲醇洗滌3 次,每次3 mL,合并提取液和洗滌液置100 mL 圓底燒瓶中,減壓濃縮至干,用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中,加甲醇定容至刻線,搖勻,靜置后取上清液,用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。
2.2 對(duì)照品溶液制備 分別稱取對(duì)照品適量,加甲醇配成適當(dāng)濃度的對(duì)照品貯備液,分析前再分別取適量配成混合對(duì)照品溶液。
2.3 色譜條件 Ultimate Plus C18色譜柱(4.6 nm×250 nm,5 μm);流動(dòng)相0.01%甲酸水(A) -乙腈(B),洗脫梯度(0~10 min,5%B;10~20 min,5%~15%B;20~60 min,15%~30% B;60 ~80 min,30%~40% B;80 ~115 min,40%~70% B;115 ~125 min,70%~100% B);體積流量(0~60 min,0.8 mL/min;60 ~80 min,0.8 ~1.0 mL/min;80~125 min,1.0 mL/min);檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm;進(jìn)樣量10 μL。
2.4 質(zhì)譜條件
2.4.1 Waters-Xevo TQD 液質(zhì)聯(lián)用儀 電噴霧(ESI) 電離源;正負(fù)離子模式全掃描;掃描范圍m/z 50 ~1 500;氮?dú)怏w積流量700 L/h;脫氣溫度450 ℃;毛細(xì)管電壓3.0 kV(ESI+),1.5 kV(ESI-);毛細(xì)管溫度500 ℃;噴霧電壓3 kV;錐孔電壓40 V;霧化氣體積流量650 L/h;輔助氣體積流量50 L/h;碰撞能量32 V;三分通流2 ∶1。
2.4.2 島津LCMS-IT-TOF 電噴霧(ESI) 電離源;正負(fù)離子模式全掃描;掃描范圍m/z 100 ~1 000;毛細(xì)管電壓4.5 kV(ESI+),3.5 kV(ESI-);毛細(xì)管溫度200 ℃;噴氣體積流量1.5 L/min;干燥氣壓力104.0 kPa;檢測(cè)器電壓1.58 kV;碎裂方式為碰撞誘導(dǎo)解離(CID);碰撞能量50%。
蘇黃止咳膠囊提取液的液相色譜圖和正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見(jiàn)圖1,所有化合物的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2,所鑒定的化合物的保留時(shí)間、分子式、質(zhì)譜數(shù)據(jù)和藥材來(lái)源歸屬見(jiàn)表1,其中表中的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Waters-Xevo TQD 獲得,多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)由LCMS-IT-TOF 獲得。共分析和鑒定出50 個(gè)化合物,包括4 個(gè)生物堿、8 個(gè)酚酸、5 個(gè)黃酮、2 個(gè)香豆素、29 木脂素和2 個(gè)其他類型化合物,其中有27 個(gè)化合物和對(duì)照品進(jìn)行對(duì)照確認(rèn),另外對(duì)檢測(cè)到的化合物的裂解途徑進(jìn)行了總結(jié)。
圖1 蘇黃止咳膠囊液相色譜圖與總離子流圖
圖2 化合物結(jié)構(gòu)式
表1 化學(xué)成分鑒定
續(xù)表1
續(xù)表1
續(xù)表1
3.1 生物堿類 通過(guò)質(zhì)譜碎片分析及對(duì)照品保留時(shí)間比對(duì),共有4 個(gè)生物堿類化合物(3 ~6) 在正離子模式下被鑒定出,均來(lái)自麻黃,主要裂解途徑為丟失一分子水。
通過(guò)和對(duì)照品對(duì)照后,化合物4~5 分別確定為麻黃堿和偽麻黃堿。以麻黃堿(4) 為例,其裂解途徑見(jiàn)圖3。其準(zhǔn)分子離子峰均為m/z 166[M+H]+,一級(jí)質(zhì)譜中均有明顯的脫水峰m/z 148[M+H-H2O]+,然后在二級(jí)質(zhì)譜中分別失去一分子甲基和氨甲基后形成m/z 133[M+H-H2OCH3]+和m/z 117[M+H-H2O-CH3NH2]+的碎片離子?;衔? 和6 的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 152[M+H]+和m/z 180[M+H]+,分別比麻黃堿少一分子甲基和多一分子甲基。因此,化合物3 和6 推斷是去甲基(偽) 麻黃堿和甲基(偽) 麻黃堿[25]。
3.2 酚酸類 共8 個(gè)酚酸類化合物(7~10、12、15、17~18) 在負(fù)離子模式下被鑒定出來(lái)。其中,有5 個(gè)化合物通過(guò)和對(duì)照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)照后確認(rèn),分別是新綠原酸(7)、綠原酸 (8)、隱綠原酸 (9)、迷迭香酸(17) 和4,5-二咖啡??鼘幩幔?8),這類化合物主要裂解途徑為酯基的酰氧鍵斷裂。
化合物7~9 和18 的結(jié)構(gòu)類似,具有相似的裂解途徑。以隱綠原酸(9) 為例,其裂解途徑見(jiàn)圖4。隱綠原酸在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 353[M-H]-,隱綠原酸結(jié)構(gòu)中C-4 位連有一個(gè)咖啡?;?,很容易先生成m/z 191[quinic-H]-的碎片離子,然后再脫水生成m/z 173[quinic-H-H2O]-的基峰碎片離子[49]。隱綠原酸的二級(jí)質(zhì)譜中還有m/z 179[caffeic-H]-的碎片離子,然后再失去一分子CO2生成m/z 135[caffeic-H-CO2]-的碎片離子。
圖3 麻黃堿裂解途徑
圖4 隱綠原酸裂解途徑
化合物15 的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 521[M-H]-,二級(jí)質(zhì)譜中的基峰為m/z 359[M-H-162]-,推測(cè)可能失去一分子葡萄糖,三級(jí)質(zhì)譜中,進(jìn)一步裂解生成m/z 197 和161的碎片離子,和迷迭香酸(17) 的碎片離子一致,推測(cè)化合物15 可能是迷迭香酸苷[36]。
化合物10 的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 337[M-H]-,二級(jí)質(zhì)譜的基峰為m/z 191[quinic-H]-。推測(cè)化合物10 可能是肉桂??崴幔?9-30]。
化合物12 在正離子模式下有2 個(gè)加合離子峰,分別為m/z 349[M+Na]+和m/z 365[M+K]+,負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 325[M-H]-,可推測(cè)此化合物的分子量為326。二級(jí)質(zhì)譜中,m/z 325 的離子生成m/z 163[M-HGlc]-和m/z 119[M-H-Glc-CO2]-的碎片離子。通過(guò)和文獻(xiàn)中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)比后[30],化合物12 推測(cè)為nebrodenside B。3.3 黃酮類 一共5 個(gè)黃酮類化合物(11、13 ~14、16、25) 在負(fù)離子模式下被鑒定出來(lái),其中化合物11 和13 為黃酮C-苷,化合物14、16 和25 為黃酮O-苷。這些化合物主要來(lái)自麻黃和枇杷葉。
3.3.1 黃酮C-苷 這類化合物的主要裂解途徑為失去60、90、120 Da 等碎片[50]。通過(guò)和對(duì)照品對(duì)照,化合物11、13確定是維采寧-2 和夏佛塔苷。以夏佛塔苷(13) 為例,其裂解途徑見(jiàn)圖5。夏佛塔苷的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 563[MH]-,在二級(jí)質(zhì)譜中生成m/z 503[M-H-60]-、m/z 473[M-H-90]-、 m/z 443[M-H-120]-、 m/z 383[M-H-120-60]-和m/z 353[M-H-120-90]-的碎片離子。三級(jí)質(zhì)譜中,m/z 353 的離子通過(guò)連續(xù)失去CO 生成m/z 325[M-H-120-90-CO]-和297[M-H-120-90-2CO]-的碎片離子。
3.3.2 黃酮O-苷 黃酮O-苷主要裂解途徑為失去葡萄糖或半乳糖(162 Da) 或鼠李糖(146 Da)[51]?;衔?6 通過(guò)和對(duì)照品對(duì)照后確認(rèn)為異鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷,可能的裂解途徑見(jiàn)圖6。異鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 477[M-H]-,二級(jí)質(zhì)譜中生成m/z 462[M-H-CH3]-、m/z 315[M-H-162]-、m/z 300[M-H-162-CH3]-、m/z 299[M-H-162-CH3-H]-、m/z 271[M-H-162-CH3-H-CO]-和m/z 255[M-H-162-CH3-H-CO2]-的碎片離子。其中基峰為m/z 299,是m/z 300 的碎片峰在高電離能下失去一分子H 而產(chǎn)生的。三級(jí)質(zhì)譜中,m/z 299 的離子通過(guò)單獨(dú)或連續(xù)中性丟失CO 和CO2生成m/z 271、255、227 和199 的碎片離子。基于相似的裂解途徑并通過(guò)和文獻(xiàn)中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)比[35],化合物14 推測(cè)為槲皮素-4′-O-β-D-半乳糖苷。
化合物25 的分子離子峰為m/z 577[M-H]-,二級(jí)質(zhì)譜中有2 個(gè)特征性離子峰,分別為m/z 431[M-H-146]-和m/z 285[M-H-292]-,其中m/z 285 的碎片離子峰為基峰,與山柰酚的質(zhì)譜碎片相同?;衔?5 的洗脫時(shí)間明顯比其它黃酮類化合物的洗脫時(shí)間長(zhǎng)很多,和文獻(xiàn)里的數(shù)據(jù)一致[43],化合物25 推測(cè)是4″-trans-p-coumaroyl-kaempferol-3-O-α-L-rhamnoside。
3.4 香豆素類 共2 個(gè)香豆素類化合物(36~37) 在正離子模式下被檢測(cè)到,主要來(lái)自前胡。都屬于3′,4′-二酰氧基取代開(kāi)洛酮類香豆素,特征碎片離子為m/z 227[46]。
化合物37 通過(guò)和對(duì)照品對(duì)照后確認(rèn)是白花前胡甲素,其裂解途徑見(jiàn)圖7。根據(jù)文獻(xiàn)[46]可知,香豆素結(jié)構(gòu)上的4′位取代基容易先脫去,然后再脫去3′位取代基。先是4′位失去中性碎片CH3COONa(82 Da) 生成m/z 327 的碎片離子,然后在3′位失去中性碎片C4H7COOH(100 Da) 生成m/z 227 的碎片離子,再通過(guò)凱林內(nèi)酯骨架丟失CO 產(chǎn)生m/z 199 的碎片離子[52]?;衔?6 和白花前胡甲素有相似的裂解途徑,推測(cè)是白花前胡香豆精Ⅱ[46]。
圖5 夏佛塔苷裂解途徑
圖6 異鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷裂解途徑
圖7 白花前胡甲素裂解途徑
3.5 木脂素類 29 個(gè)木脂素類化合物被鑒定出,其中有6個(gè)木脂素類化合物(19~24) 來(lái)自牛蒡子,23 個(gè)木脂素類化合物(26~35、38 ~50) 來(lái)自五味子。牛蒡子中的木脂素主要屬于二芐基丁內(nèi)酯型木脂素,比較容易在負(fù)離子模式下檢測(cè)到,部分化合物也可以在正離子模式下檢測(cè)到;五味子中的木脂素主要屬于聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素,均在正離子模式下檢測(cè)到。
3.5.1 牛蒡子中的木脂素 這類木脂素都有相似的裂解途徑,在正離子模式下主要脫去H2O,在負(fù)離子模式下主要脫去CH3和CO2。通過(guò)和對(duì)照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)照后,化合物20~21、24 分別被鑒定為牛蒡苷、羅漢松樹(shù)脂酚和牛蒡子苷元。以牛蒡苷(20) 為例,其裂解途徑見(jiàn)圖8。在正離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜給出了2 個(gè)加合離子m/z 557[M+Na]+和m/z 573[M+K]+,二級(jí)質(zhì)譜中通過(guò)脫去一分子葡萄糖生成m/z 395[M+Na-Glc]+和m/z 373[M+HGlc]+的碎片離子,m/z 373 的碎片離子通過(guò)失去一分子水生成m/z 355[M+H-Glc-H2O]+的碎片離子,m/z 137 和m/z 237 的碎片離子是芐基的C7-C8 位鍵斷裂后形成的,m/z 237 的碎片離子進(jìn)一步脫水生成m/z 219 的碎片離子。負(fù)離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜給出了一個(gè)加合離子m/z 579[M+HCOO]-,二級(jí)質(zhì)譜中通過(guò)失去HCOOH 生成m/z 533[MH]-的準(zhǔn)分子離子峰,繼續(xù)裂解生成m/z 371[M-H-Glc]-的碎片離子,然后再裂解分別生成m/z 356[M-H-Glc-CH3]-和m/z 312[M-H-Glc-CH3-CO2]-的碎片離子。
圖8 牛蒡苷裂解途徑
化合物19 比羅漢松樹(shù)脂酚(21) 的分子量多162,應(yīng)該是多一分子葡萄糖,推測(cè)19 是羅漢松樹(shù)脂酚苷[39]。
化合物22~23 的正離子模式下有2 個(gè)加合離子m/z 559[M+Na]+和m/z 575[M+K]+,負(fù)離子模式下有一個(gè)準(zhǔn)分子離子峰m/z 535[M-H]-,因此也可判斷出其分子量均為536,且互為同分異構(gòu)體。兩者均有m/z 517[M-H-H2O]-、m/z 505[M-H-CH2O]-、m/z 502[M-H-H2O-CH3]-的碎片離子峰,根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的關(guān)于它們?cè)谝合嘀械南疵擁樞颍?2],可推測(cè)分別是異牛蒡酚A 和牛蒡酚A。
3.5.2 五味子中的木脂素 通過(guò)和對(duì)照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)照,一共11 個(gè)木脂素(26~28、30、34、40~41、43、45、47 和49)。通過(guò)研究這幾個(gè)化合物的質(zhì)譜碎片和裂解途徑,總結(jié)出這類木脂素的C-1、C-14 和八元環(huán)(C-6、C-7、C-8 和C-9) 是其活性部位,這些位置上的取代基比較容易脫去。由于在聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素的苯環(huán)上存在很多甲氧基基團(tuán)。因此,連續(xù)地丟失甲基和甲氧基是其主要裂解途徑。由于位阻效應(yīng),C-1 和C-14 位的甲氧基基團(tuán)活性較強(qiáng),比較容易失去[53]。這類木脂素一般比較容易失去CH3(15 Da)、H2O(18 Da)、CH3O(31 Da)、C3H6(42 Da)、C2H4O(44 Da)、C5H10(70 Da)、C5H8O2(100 Da)、C7H6O2(122 Da) 和C6H10O3(130 Da)。
以當(dāng)歸酰戈米辛H(30) 為例,其裂解途徑見(jiàn)圖9。其一級(jí)質(zhì)譜給出2 個(gè)加合峰m/z 523[M+Na]+和m/z 539[M+K]+,除此之外,一級(jí)質(zhì)譜中還發(fā)現(xiàn)了m/z 483[M+HH2O]+和m/z 401[M+H-C5H8O2]+的碎片離子,分別是C-8位脫水和C-1 位脫去當(dāng)歸酸(100 Da) 而生成的。二級(jí)質(zhì)譜中,m/z 401 的離子通過(guò)單獨(dú)或連續(xù)失去H2O、CH3、CO和CH3O 中性碎片生成m/z 386、370、355、337、327、322和309 的碎片離子峰。
基于相似的裂解途徑,化合物29、31 ~33、35、38 ~39、42、44、46、48、50 分別被鑒定出[45-48]。
3.6 其他化合物 化合物1 的一級(jí)質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 191[M-H]-。二級(jí)質(zhì)譜中,生成m/z 173[M-H-H2O]-和m/z 111[M-H-2H2O-CO2]-的碎片離子。通過(guò)和對(duì)照品對(duì)照后確認(rèn)為是檸檬酸。
化合物2 的一級(jí)質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 268[M+H]+。二級(jí)質(zhì)譜通過(guò)失去一分子戊糖(132 Da) 生成m/z 136 的碎片離子。通過(guò)和對(duì)照品對(duì)照后確認(rèn)是腺苷。
圖9 當(dāng)歸酰戈米辛H 裂解途徑
本文采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)建立了蘇黃止咳膠囊中非揮發(fā)性成分的定性分析方法。采用該方法,分析和鑒定了蘇黃止咳膠囊提取物中的50 個(gè)化學(xué)成分,并對(duì)這些化合物進(jìn)行了藥材來(lái)源歸屬。這些化合物中包括4 個(gè)生物堿、8 個(gè)酚酸、5 個(gè)黃酮、2 個(gè)香豆素、29 個(gè)木脂素和2 個(gè)其他類型化合物,其中27 個(gè)化合物通過(guò)和對(duì)照品對(duì)照后確認(rèn)。鑒定出的化合物大部分為木脂素,主要來(lái)自五味子。該結(jié)果基本闡明了蘇黃止咳膠囊的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ),以期為后續(xù)的質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。