黃渝茜， 晏旭航， 晏 容，， 劉 云， 楊明潔， 陳威天， 古宸廷， 李 埝，羅明星， 李曉飛，?

（1.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563000）

斑蝥是一種重要的抗腫瘤蟲類中藥，對(duì)原發(fā)性肝癌可達(dá)到良好效果［1-2］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，斑蝥體內(nèi)含有游離斑蝥素和斑蝥素鹽類物質(zhì)，主要包括斑蝥素酸鈣、斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鉀等［3-4］，其中斑蝥素酸鎂對(duì)肝癌治療效果較游離斑蝥素和其他斑蝥素鹽類物質(zhì)效果更佳［5-7］；后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)斑蝥素酸鎂作用后肝癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象［8-9］，但具體機(jī)制不清。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402 增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，并與同為蛋白磷酸酶2 A（PP2A） 抑制劑的促癌物岡田酸進(jìn)行比較，探討斑蝥素酸鎂的抗肝癌機(jī)制，為其進(jìn)一步研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 斑蝥素酸鎂是將斑蝥素與氫氧化鎂反應(yīng)制備而來(lái)，干燥后得到白色結(jié)晶粉末，含有量在90%以上；斑蝥素酸鎂由課題組自主合成，制備方法已授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利（ZL201110149288.5）［10］。 岡田酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。BEL-7402 人肝癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RMPI-1640 購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司；活性氧（ROS）、線粒體膜電位、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗、HRP 標(biāo)記羊抗鼠二抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；兔抗細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1／2） 單克隆抗體、兔抗磷酸化ERK1／2多克隆抗體、兔抗Cyt-C 多克隆抗體、小鼠抗半胱天冬酶-3（Caspase-3） 單克隆抗體、兔抗裂解半胱天冬酶-3（Cleaved-Caspase-3） 多克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 儀器 3131 型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan spectrum 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；超凈工作臺(tái)，購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；FC500 MCL 流式細(xì)胞儀，購(gòu)自美國(guó)Beckman 公司；mini protean 3 cell 電泳儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；SP-9 型電轉(zhuǎn)儀，購(gòu)自大連競(jìng)邁科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 完全培養(yǎng)基（RPMI1640） 培養(yǎng)細(xì)胞，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 磺酰羅丹明B（SRB） 染色法 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96 孔板中，1 塊作為對(duì)照組（T0），另1 塊作為實(shí)驗(yàn)組（T）。培養(yǎng)20 h 后將T0取出，預(yù)冷的50%三氯乙酸（TCA）固定［11］，實(shí)驗(yàn)板中加入不同濃度（1.668、3.336、5.004、6.672 μmol／L） 斑蝥素酸鎂，同時(shí)以加入等量培養(yǎng)基的腫瘤細(xì)胞作為空白對(duì)照組（C），實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組分別設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后參照文獻(xiàn)［12］ 報(bào)道進(jìn)行固定、染色、溶解，于530 nm 處測(cè)定光密度（OD） 值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，公式為生長(zhǎng)抑制率= ［1-ODT-ODT0／ODC-ODT0］ ×100% （設(shè)置對(duì)照組是為了排除加藥前細(xì)胞生長(zhǎng)速度差異對(duì)最終細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，能更好地反映藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用）。

2.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 細(xì)胞按1×104／孔密度接種于6 孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，再分別加入配置好的岡田酸 （終濃度0.072 nmol／L） 和不同濃度 （2.43、4.86、9.72 μmol／L） 斑蝥素酸鎂，對(duì)照組加等量培養(yǎng)基，每組平行3 次，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后，采用Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，Annexin V-FITC 為綠色熒光，對(duì)應(yīng)BD 流式細(xì)胞儀FL1 檢測(cè)通道；碘化丙啶（PI） 為紅色熒光，對(duì)應(yīng)BD 流式細(xì)胞儀FL2 檢測(cè)通道。

2.4 活性氧（ROS） 水平檢測(cè) 同法培養(yǎng)細(xì)胞和分組，按照ROS 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。收集細(xì)胞后，加入500 μL DCFH-DA 工作液（10 μmol／L），無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1～2 次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)CXP軟件進(jìn)行分析。

2.5 線粒體膜電位檢測(cè) 同法培養(yǎng)細(xì)胞和分組，按照線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。收集細(xì)胞后，加入0.5 mL JC-1 染色工作液，顛倒數(shù)次混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃下孵育20 min，37 ℃孵育結(jié)束后，4 ℃下600×g 離心3～4 min，沉淀細(xì)胞，棄上清后用預(yù)先配置好的JC-1 染色緩沖液 （1X） 洗滌2 次，加入1 mL JC-1 染色緩沖液（1X） 重懸細(xì)胞，4 ℃下600×g 離心3 ～4 min，沉淀細(xì)胞，棄上清，再加入1 mL JC-1 染色緩沖液（1X） 重懸細(xì)胞，4 ℃下600×g 離心3～4 min，沉淀細(xì)胞，棄上清，適量JC-1染色緩沖液（1X） 重懸后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)［13］。然后，通過(guò)CXP 分析軟件進(jìn)行分析。

2.6 細(xì)胞色素c（Cyt-C）、半胱天冬酶-3（Caspase-3）、裂解半胱天冬酶-3（Cleaved-Caspase-3）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1／2） 蛋白磷酸化表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 法。細(xì)胞加藥培養(yǎng)24 h 后棄上清，收集細(xì)胞，RIPA 裂解，提取蛋白。BCA 定量后，20 μg 提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，半干式電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜后室溫封閉1 h，一抗（GAPDH，1 ∶ 10 000； ERK1／2，1 ∶ 1 000； p-ERK1／2，1 ∶1 000；Cyt-C， 1 ∶ 1 000； Caspase-3， 1 ∶ 1 000；Cleaved-Caspase-3，1 ∶800）4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST 漂洗3次，每次5 min，置于HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗（或HRP 標(biāo)記羊抗鼠二抗） （1 ∶10 000）37 ℃下孵育1 h，TBST 漂洗3次，每次5 min，將其浸入ECL 液中2 min。最后，X 光膠片進(jìn)行曝光、顯影、定影，并進(jìn)行灰度分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過(guò)SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 斑蝥素酸鎂對(duì)BEL-7402 人肝癌細(xì)胞的抑制作用 圖1 顯示，1.668 μmol／L 斑蝥素酸鎂對(duì)細(xì)胞有明顯抑制作用，并隨著其濃度升高抑制率逐漸增大。以斑蝥素酸鎂濃度為橫坐標(biāo)（X），縱坐標(biāo)為抑制率（Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y=13.765X-16.95（R2=0.995 4），IC50為4.86 μmol／L。

3.2 斑蝥素酸鎂對(duì)BEL-7402 人肝癌細(xì)胞凋亡率的影響圖2 顯示，斑蝥素酸鎂組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較均顯著增加（P＜0.01），并呈濃度依賴效應(yīng)，但岡田酸組顯著減少（P＜0.01）。

3.3 斑蝥素酸鎂對(duì)ROS 水平的影響 圖3 顯示，與對(duì)照組比較，2.43 μmol／L 斑蝥素酸鎂組ROS 水平顯著增加（P＜0.01），并呈濃度依賴效應(yīng)，但岡田酸組顯著減少（P＜0.05）。

圖1 斑蝥素酸鎂對(duì)BEL-7402 人肝癌細(xì)胞的抑制作用

圖2 斑蝥素酸鎂對(duì)BEL-7402 人肝癌細(xì)胞凋亡率的影響

3.4 斑蝥素酸鎂對(duì)線粒體膜電位的影響 圖4 顯示，斑蝥素酸鎂組線粒體膜電位與對(duì)照組比較均顯著降低 （P ＜0.01），并呈濃度依賴效應(yīng)，但岡田酸組無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

圖3 斑蝥素酸鎂對(duì)ROS 水平的影響

圖4 斑蝥素酸鎂對(duì)線粒體膜電位的影響

3.5 斑蝥素酸鎂對(duì)Cyt-C、Cleaved Caspase-3、Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響 圖5 顯示，與對(duì)照組比較，2.43 μmol／L 斑蝥素酸鎂組Cyt-C、Cleaved-Caspase-3、Caspase-3 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），并呈濃度依賴效應(yīng)，但岡田酸組顯著下調(diào)（P＜0.01）。

圖5 斑蝥素酸鎂對(duì)Cyt-c、Cleaved Caspase-3、Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響

3.6 斑蝥素酸鎂對(duì)ERK1／2 蛋白磷酸化表達(dá)的影響 圖6顯示，與對(duì)照組比較，2.43 μmol／L 斑蝥素酸鎂組ERK1／2蛋白磷酸化表達(dá)顯著下降（P＜0.01），并呈濃度依賴效應(yīng)，但岡田酸組顯著上升（P＜0.01）。

4 討論

細(xì)胞凋亡是一種多種基因調(diào)控的主動(dòng)程序化死亡過(guò)程，經(jīng)典的途徑分為3 條，包括死亡受體、線粒體凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［14］，其中在動(dòng)物細(xì)胞中線粒體途徑是最普遍的凋亡機(jī)制和細(xì)胞凋亡核心［15］。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線粒體產(chǎn)生大量ROS，引起線粒體膜電位下降，cyt-C 釋放到細(xì)胞漿中，從而激活半胱天冬酶-9（Caspase-9）， 并激活下游Caspase-3［16-17］，它是Caspase 家族重要組成部分，在凋亡過(guò)程中充當(dāng)?shù)蛲鰣?zhí)行蛋白者的角色［18-19］，而Caspase-3 活化過(guò)程中能產(chǎn)生Cleaved Caspase-3，其活性和細(xì)胞凋亡情況可由表達(dá)程度反映［20］，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2.43 μmol／L 斑蝥素酸鎂作用24 h 后能顯著升高肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，具有濃度依賴效應(yīng)。細(xì)胞凋亡過(guò)程中首先會(huì)引起活性氧大量增加，線粒體功能發(fā)生障礙，釋放cyt-C［17］，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)斑蝥素酸鎂組線粒體膜電位明顯下降，cyt-C 表達(dá)明顯升高，符合上述理論。在此基礎(chǔ)上，又檢測(cè)凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3、Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)斑蝥素酸鎂組兩者明顯升高，具有濃度依賴效應(yīng)，表明該成分可能通過(guò)線粒體凋亡途徑來(lái)誘導(dǎo)BEL-7402 人肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖6 斑蝥素酸鎂對(duì)ERK1／2 蛋白磷酸化表達(dá)的影響

課題組前期發(fā)現(xiàn)，斑蝥素酸鎂能顯著下調(diào)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 的ERK1／2 磷酸化水平，提示ERK1／2 通路可能在該成分抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1／2（ERK1／2） 是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)蛋白，屬于增殖相關(guān)蛋白激酶（MAPK），在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［21］，前期報(bào)道苦參堿衍生物WM130 誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡與ERK1／2 通路的抑制密切相關(guān)［22］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相符，即2.43 μmol／L 斑蝥素酸鎂組ERK1／2 蛋白磷酸化表達(dá)顯著下調(diào)，具有濃度依賴效應(yīng)，而細(xì)胞凋亡率卻明顯升高，提示ERK1／2 通路可能與斑蝥素酸鎂誘導(dǎo)的BEL-7402人肝癌細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)。

研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK） 信號(hào)通路可以將凋亡信號(hào)傳遞給線粒體［23］，線粒體凋亡途徑主要包含B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（Bcl-2） 家族成員，它和BCL-2-Associated X 的蛋白質(zhì)（Bax） 在細(xì)胞中凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［24］。據(jù)文獻(xiàn)［25］ 報(bào)道，大黃素能抑制細(xì)胞中ERK1／2 磷酸化，隨之Bcl-2 表達(dá)下調(diào)，cyt-C 釋放到胞漿，最終引起Caspase-3 活化，引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，斑蝥素酸鎂可明顯降低線粒體膜電位，導(dǎo)致cyt-C 釋放，進(jìn)而激活Caspase-3，同時(shí)還能明顯抑制ERK1／2 磷酸化水平，故推測(cè)斑蝥素酸鎂可能通過(guò)抑制ERK1／2 磷酸化水平，反向調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑，最終誘導(dǎo)BEL-7402 人肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，但對(duì)ERK1／2 通路具體調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。