張 琳， 趙梓邯， 于冰莉， 崔 潔， 侯俊玲，3?， 王文全，3

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193；3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京100102）

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根莖［1］，用藥歷史悠久，市場(chǎng)需求量大，但一直以來(lái)大量地上部分未得到有效利用而廢棄，造成資源浪費(fèi)。研究表明，甘草地上部分中黃酮類成分含有量高，并有較好的藥理活性，已從中分離得到61 個(gè)黃酮類化合物和7 個(gè)酚類化合物［2］；地上、地下部分中黃酮類成分HPLC指紋圖譜差異很大，以前者葉中含有量更高［3］；該部分中黃酮類成分具有良好的抗氧化及抗炎活性［4］，尤其對(duì)前列腺炎有較顯著的預(yù)防和治療作用［5］。

前列腺炎是最常見(jiàn)的泌尿生殖系統(tǒng)疾病，會(huì)導(dǎo)致排尿不暢、尿液潴留、性功能障礙等癥狀，流行病學(xué)調(diào)查顯示，慢性前列腺炎／慢性骨盆疼痛綜合征在男性人群中的發(fā)病率高達(dá)2.5%～16%［6］，其病情大多與久坐、疲勞、禁欲縱欲、吸煙飲酒等多種因素有關(guān)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)慢性前列腺炎的發(fā)病機(jī)制存在廣泛爭(zhēng)議，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為可能是病原體感染、炎癥、異常的盆底神經(jīng)肌肉活動(dòng)和免疫異常等共同作用的結(jié)果［7］，導(dǎo)致相關(guān)治療十分困難。

本實(shí)驗(yàn)以甘草地上部分為研究對(duì)象，考察它對(duì)慢性前列腺炎大鼠的影響，既為前列腺炎臨床治療提供新的天然藥物，又為甘草綜合開(kāi)發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量280 g左右，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)，每天自由飲水進(jìn)食， 動(dòng)物合格證號(hào)SCXK （京）2016-0006。

1.2 試藥 甘草地上部分于2016 年9 月采自甘肅省酒泉市瓜州縣河?xùn)|鄉(xiāng)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王文全教授鑒定為甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的地上部分。前列康（浙江康恩貝制藥股份有限公司）；槲皮素（上海源葉生物科技有限公司）；角叉菜膠（北京索萊寶科技有限公司）；水合氯醛、羧甲基纖維素鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 儀器 FA2 004 N 型分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）；RE-52 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；101-2AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；KH-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZN-02 型粉碎機(jī)（北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司）；移液槍（德國(guó)Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1.1 甘草水提物 甘草地上部分打粉，以1 ∶10 料液比用去離子水煎煮2 次，每次1.5 h，趁熱過(guò)濾，濃縮濾液，55 ℃下烘干，即得，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 甘草醇提物 按照課題組前期所得最佳工藝進(jìn)行提取，并稍作調(diào)整。條件為70%乙醇，料液比1 ∶10，70 ℃下超聲提取20 min，濃縮濾液，55 ℃烘干，即得，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組、造模與給藥 40 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、水提組、醇提組、陽(yáng)性組，每組8 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后在無(wú)菌條件下以10%水合氯醛麻醉，腹正中切口至腹腔，提出膀胱及兩側(cè)精囊。除假手術(shù)組大鼠注射等量生理鹽水外，其余各組前列腺腹側(cè)葉注入0.1 mL 角叉菜膠生理鹽水溶液，注射后縫合肌肉、皮膚［8-9］。水提組大鼠灌胃給予1 g／kg 藥物CMC-Na 溶液，醇提組大鼠灌胃給予1 g／kg藥物CMC-Na 溶液，陽(yáng)性組大鼠灌胃給予0.552 g／kg前列康CMC-Na 溶液，假手術(shù)組、模型組大鼠灌胃給予20 mL／kg 0.7%CMC-Na 溶液，每天1 次，連續(xù)30 d。

2.3 取樣及指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥24 h 后麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，處死，取前列腺、胸腺，吸干臟器表面液體和血液，稱定質(zhì)量并記錄，計(jì)算臟器指數(shù)，并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。2.3.1 血清PGE2、MCP-1、NF-κB 表達(dá) 血樣放置4 h 后離心15 min，取血清，ELISA 試劑盒檢測(cè)PGE2、MCP-1、NF-κB 表達(dá)。

2.3.2 前列腺組織病理變化 取出部分大鼠前列腺組織，10%甲醛溶液固定， 常規(guī)石蠟包埋切片， 進(jìn)行HE、Masson、免疫組化染色，鏡檢觀察其病理變化。

2.3.2.1 HE 染色［10］按照各給藥組前列腺腺體組織病變程度，將其形態(tài)學(xué)變化分為3 個(gè)等級(jí)進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，對(duì)各項(xiàng)病理變化評(píng)分計(jì)算總和作為整體評(píng)分。主要從腺體形態(tài)、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生程度3 個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下。

腺體形態(tài)：腺上皮單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，細(xì)胞呈柱狀、立方形，腺體上皮向管腔內(nèi)折疊形成皺襞——2分；腺上皮輕度增生，有損傷，腺體上皮皺襞減少——4分；腺上皮受損變形嚴(yán)重，腺上皮皺襞減少或無(wú)——6 分。

瑞安嘆息了一聲，用一只手拽起頭發(fā)?！昂冒?，我明白了。只是要答應(yīng)我，假如外星人打過(guò)來(lái)了，你會(huì)脫身后再來(lái)找我。”

炎癥表現(xiàn)情況及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度：腺腔偶見(jiàn)炎性細(xì)胞——2 分；腺腔中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)——4 分；腺腔充滿炎性細(xì)胞，且伴有充血現(xiàn)象——6 分。

纖維組織增生程度：極少纖維組織增生——2 分；纖維組織增生程度較輕——4 分；腺體周圍有大量纖維組織增生，包被腺體——6 分。

2.3.2.2 Masson 染色 通過(guò)Image-pro Plus 軟件進(jìn)行定量分析，通過(guò)計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域的光密度值來(lái)綜合評(píng)價(jià)各組纖維組織增生情況。

2.3.2.3 免疫組化染色 通過(guò)Image-pro Plus 軟件進(jìn)行半定量分析，以平均光密度為指標(biāo)評(píng)價(jià)大鼠前列腺組織中TNF-α 表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SAS 8.2 軟件進(jìn)行處理，組間比較采用方差分析。P＜0.05 表示有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀況和解剖體征 圖1 顯示，給藥期間大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)趨勢(shì)一致，組間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；第2 周開(kāi)始，模型組大鼠體質(zhì)量增加程度略低于假手術(shù)組，可能是疾病給大鼠帶來(lái)一定痛苦，導(dǎo)致其食欲降低，體質(zhì)量增長(zhǎng)稍慢。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化

圖2 顯示，假手術(shù)組大鼠前列腺表面紅潤(rùn)有光澤，腺體組織柔軟且有彈性；模型組大鼠腺體發(fā)紅、腫大；給藥組大鼠腺體紅腫現(xiàn)象均有一定程度改善，但水提組有3 只出現(xiàn)肝病變，其中1 只左側(cè)腹腔出現(xiàn)瘤狀物，醇提組有1只大鼠出現(xiàn)肝病變。

圖2 各組大鼠解剖體征病變

3.2 臟器指數(shù) 圖3 顯示，模型組大鼠前列腺指數(shù)略高于假手術(shù)組，但各組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），水提組相對(duì)較低；模型組大鼠胸腺指數(shù)顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），各給藥組均有不同程度的降低，以水提組、醇提組更明顯（P＜0.05），表明水提物和醇提物能有效降低胸腺指數(shù)。

3.3 MCP-1、NF-κB、PGE2 表達(dá) 圖4 顯示，模型組MCP-1、NF-κB、PGE2 表達(dá)顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；各給藥組MCP-1 表達(dá)均有降低趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；各給藥組NF-κB 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），以水提組更明顯；水提組、陽(yáng)性組PGE2 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

3.4 大鼠前列腺組織病理形態(tài) 圖5 ～6 顯示，假手術(shù)組大鼠前列腺組織腺體完整，腺上皮單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)萎縮，細(xì)胞間質(zhì)炎性細(xì)胞少，無(wú)纖維組織增生情況，腺腔內(nèi)分泌物豐富；模型組大鼠前列腺腺體變形嚴(yán)重，腺體萎縮，腺上皮皺襞減少，有脫落、壞死現(xiàn)象，部分腺上皮呈乳頭狀增生，腺體間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，有明顯的水腫現(xiàn)象，腺腔內(nèi)分泌物減少；陽(yáng)性藥組大鼠腺體變形有所改善，腺體間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組減輕，部分腺腔內(nèi)無(wú)分泌物；水提組大鼠前列腺組織腺體完整，上皮細(xì)胞排列較為整齊，間質(zhì)水腫明顯減輕，炎癥細(xì)胞和分泌物明顯減少；醇提組大鼠前列腺組織完整，但仍可見(jiàn)前列腺腺體稍有變形，部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，改善情況不如水提物組。

圖3 各組大鼠前列腺（A）、胸腺（B） 指數(shù)

圖4 各組MCP-1（A）、NF-κB（B）、PGE2（C） 表達(dá)

圖5 各組大鼠前列腺組織病理形態(tài)（HE 染色，×200）

圖6 各組大鼠前列腺組織病理評(píng)分

圖7 顯示，模型組大鼠前列腺組織纖維化程度高于假手術(shù)組，而甘草水提物組、醇提物組、陽(yáng)性組大鼠有一定程度的緩解。

圖7 各組大鼠前列腺組織病理形態(tài)（Masson 染色，×400）

3.5 TNF-α 表達(dá) 圖8 顯示，假手術(shù)組大鼠基本無(wú)陽(yáng)性表達(dá)；模型組大鼠細(xì)胞質(zhì)、腺上皮細(xì)胞中存在大面積陽(yáng)性表達(dá)；水提組大鼠TNF-α 表達(dá)較模型組有很大程度減少，并且優(yōu)于醇提組；醇提組大鼠TNF-α 表達(dá)較模型組稍有減少；陽(yáng)性組大鼠與假手術(shù)組接近。圖9 顯示，模型組TNF-α 表達(dá)顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），各給藥組均能顯著降低其表達(dá)（P＜0.05），并且水提物組優(yōu)于醇提物組。

圖8 各組TNF-α 表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖9 各組TNF-α 表達(dá)

4 討論

目前對(duì)慢性前列腺炎發(fā)病機(jī)制尚未明確［11］，國(guó)內(nèi)外有多種建模方法，而本實(shí)驗(yàn)采用注射角叉菜膠溶液。結(jié)果顯示，模型組MCP-1、NF-κB、PGE2 表達(dá)明顯提高，腺體變形嚴(yán)重，腺上皮有脫落、壞死現(xiàn)象，腺體間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，有明顯的水腫、纖維化現(xiàn)象，表明模型建立成功。

MCP-1 是一種重要的單核細(xì)胞激活因子，可誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，在多種炎癥疾病評(píng)價(jià)中有重要參考價(jià)值；NFκB 是細(xì)胞胞漿中的反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥中的免疫反應(yīng)，其表達(dá)可引發(fā)多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而使炎癥反應(yīng)加劇；PGE2 在炎癥過(guò)程中有致熱作用，也可引發(fā)水腫，而炎癥和水腫是導(dǎo)致前列腺炎患者尿路刺激癥產(chǎn)生的主要原因之一；TNF-α 是重要的炎癥因子，能誘導(dǎo)趨化因子產(chǎn)生，使上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表達(dá)黏附分子，導(dǎo)致組織細(xì)胞增生、組織損傷等病理變化［11］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甘草地上部分醇提物能明顯降低血清NF-κB 表達(dá)，而水提物能明顯降低NFκB、PGE2 表達(dá)，并在一定程度上降低前列腺組織中TNF-α表達(dá)，減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生情況，并且效果優(yōu)于醇提物。

綜上所述，甘草地上部分水提物有較好的抗前列腺炎作用，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分大鼠出現(xiàn)肝病變，其潛在毒性有待進(jìn)一步確認(rèn)。因此，今后將對(duì)甘草地上部分進(jìn)行系統(tǒng)的毒理學(xué)研究和安全性評(píng)價(jià)，為其資源合理開(kāi)發(fā)利用提供理論指導(dǎo)。