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        艾司唑侖聯(lián)合黃連阿膠湯加減對腦卒中后失眠血虧陰虛證大鼠的影響

        2019-07-23 11:42:58張紅艷池發(fā)斌許素燕王愛鳳
        中成藥 2019年6期
        關鍵詞:艾司阿膠下丘腦

        張紅艷, 池發(fā)斌, 張 寧, 許素燕, 王愛鳳?

        (1.阜外華中心血管病醫(yī)院河南省人民醫(yī)院心臟中心藥學部,河南鄭州450000;2.河南省人民醫(yī)院藥學部,河南 鄭州450003)

        1 材料

        1.1 動物 SPF 級健康雄性Wistar 大鼠75 只,體質量(210±20) g,由河南中醫(yī)藥大學科研實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)證號SYXK(豫)2012-00009,分籠飼養(yǎng)。實驗前3 d 適應環(huán)境,自由飲水,自然光照,室溫 (20±2)℃。

        1.2 試藥 黃連阿膠湯加減由免煎中藥顆粒生地、當歸各20 g,黃連、黃芩各12 g,黃芪、阿膠各9 g,白芍6 g(江陰天江藥業(yè)有限公司) 組成。艾司唑侖片(四川大冢制藥有限公司,批號H20170205)。5-HT、5-HIAA 酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海賽默生物科技發(fā)展有限公司;NA、DA 酶聯(lián)免疫試劑盒購自美國R&D 公司;PBS 緩沖液、DAB 顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;RIPA 裂解液、PMSF、蛋白上樣緩沖液購自蘭州晟威生物科技有限公司。1.3 儀器 BS110S 型電子天平購自德國賽多利斯公司;XJ80-2 型醫(yī)用離心機購自金壇市恒豐儀器廠;ND-97 型數(shù)字化腦電圖儀購自上海醫(yī)療器械高技術公司;56100 型大鼠腦立體定位儀購自美國Stoelting 公司;TSJ-II 型全自動封閉式組織脫水機購自常州市中威電子儀器有限公司;7230G 型分光光度計購自上海精密儀器儀表有限公司;MT-360 型液體快速混合器購自常州德杜精密儀器有限公司;043BR38725 型電泳儀購自新加坡ESCO 公司;1305529 型轉膜儀、1124003 型凝膠拍照儀購自北京賽百奧科技有限公司;PVDF 膜,購自蘭州晟威生物科技有限公司;HH-702 型超級恒溫水浴鍋購自北京晨曦勇創(chuàng)科技有限公司。手術器械、縫合針由河南中醫(yī)藥大學科研實驗中心提供。

        2方法

        2.1 造模

        2.1.1 腦卒中模型 參照Koizumi[5]報道的方法建立,并加以改良。大鼠仰臥位固定,頸部備皮,消毒,注射3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg) 麻醉,頸部正中切口,逐層分離組織以充分暴露右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈,同時分離迷走神經(jīng)以免誤傷而出現(xiàn)呼吸驟停,結扎頸總動脈近心端及頸外動脈根部,備線打一活結,動脈夾夾閉遠心端,于分叉處下方剪一斜行切口,將備好的漁線從切口處插入,輕輕旋轉,由切口處進入約(18.5±0.5) mm,有阻力感時停止推進,此時已阻斷了大腦中動脈入口,然后立即備線結扎,固定線栓以防止出血,撤去動脈夾,縫合傷口,消毒,漁線暴露在皮膚之外,2 h 后拔出漁線;空白組漁線插入僅10 mm,其余步驟同上。再灌注48 h 后將大鼠處死,留取標本待測,造模后24 h 參照Zea Longa[6]報道的方法進行神經(jīng)系統(tǒng)功能評分。

        2.1.2 失眠血虧陰虛證模型 在腦卒中模型基礎上參照游秋云等[7]報道的方法建立。 大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺(100 mg/kg) 制備血虧模型,同時腹腔注射氫化可的松(50 mg/kg) 制備陰虛證模型。

        2.2 分組與給藥 75 只大鼠按體質量隨機分為空白組、模型組、聯(lián)合組[艾司唑侖(2 mg/kg) +黃連阿膠湯加減(18.0 g/kg) ]、艾司唑侖組(2 mg/kg)、黃連阿膠湯加減組(18.0 g/kg),每組15 只,剔除死亡和不符合納入標準者,每組隨機取10 只。給藥組大鼠按5 mL/kg 劑量灌胃給藥,空白組、模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水,1 次/d,連續(xù)14 d。

        2.3 指標檢測

        2.3.1 睡眠時相[8]大鼠覺醒-睡眠周期包括Wake 期、SWS1 期、SWS2 期、REMS 期,TST=SWS1 期+SWS2 期+REMS 期。規(guī)定每一個獨立的睡眠時相持續(xù)時間>20 s,并將20 s 作為一個睡眠時相的分析單元。

        本研究的結果可以為海洋溢油的微生物修復提供優(yōu)良菌源和基礎數(shù)據(jù)。但論文中很多的研究工作還處于初始階段,未來應進一步深化研究。

        2.3.2 腦干和下丘腦中GAD、GS 蛋白表達[9]采用免疫印跡進行測定。

        2.3.2.1 樣本制備 脫頸椎處死大鼠,取腦組織,稱定質量后剪碎,加入RIPA 裂解液和PMSF,勻漿、超聲(消耗功率160 W,加熱功率260 W,頻率59 kHz)15 min,4 ℃離心(12 000 r/min)10 min,取上清液,作為總蛋白。雙光束紫外可見分光光度計進行蛋白定量(嚴格按照儀器操作說明),加入蛋白上樣緩沖液。

        2.3.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 10%丙烯酰胺配置分離膠后,移至兩層玻璃板之間進行膠凝,3.9%丙烯酰胺配置濃縮膠,灌注,封口,膠凝,膠板置于電泳槽中,倒入電泳緩沖液,加入樣品和Maker,當目標條帶跑到分離膠底部時停止電泳,取膠。

        2.3.2.3 轉膜 依據(jù)凝膠大小剪下濾紙和PVDF 膜,按順序放好濾紙、PVDF 膜、凝膠,連接電極,100 V 下轉移1 h。

        2.3.2.4 封閉 轉膜后取PVDF 膜,置于封閉液中封閉3 h,然后放入一抗、二抗,室溫下分別孵育2 h。

        2.3.2.5 顯色 在膜上滴顯色AB 液,即刻放到凝膠成像系統(tǒng)拍照。

        2.3.3 下丘腦中神經(jīng)遞質水平[10]取大鼠全腦組織,冰冷生理鹽水除去腦膜血管,冰冷平皿中分離下丘腦,稱定質量,加入正丁醇,在玻璃勻漿器中勻漿,離心(3 000 r/min)5 min,吸取上清液2 mL,加入pH 6.5 磷酸鹽緩沖液,搖勻,與氧化碘試劑行反應,測定下丘腦中5-HT、NA、5-HIAA、DA 吸光度,繪制標準曲線,換算成其水平。

        2.3.4 血漿中神經(jīng)遞質水平 處死大鼠后取腹主動脈血5 mL,加肝素抗凝,離心(3 000 r/min) 10 min,嚴格按照酶聯(lián)免疫試劑盒操作測定血漿中5-HT、NA、5-HIAA、DA 水平。

        2.4 統(tǒng)計學分析 通過SPSS16.0 軟件進行處理,計量資料以表示,多組間比較用單因素方差分析,2 組間比較采用t 檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

        3 結果

        3.1 對大鼠睡眠時相的影響 表1 顯示,與空白組比較,模型組SWS1、SWS2、REMS、TST 顯著縮短(P<0.05);與模 型 組 比 較, 聯(lián) 合 組、 艾 司 唑 侖 組SWS1、 SWS2、REMS、TST 顯著延長 (P <0.05),黃連阿膠湯加減組SWS2、REMS 顯著延長(P<0.05)。

        表1 對大鼠睡眠時相的影響

        表1 對大鼠睡眠時相的影響

        注:與空白組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

        組別 劑量/(g·kg-1) Wake/sSWS1/sSWS2/s REMS/s TST/s空模聯(lián)艾黃白型合司連組組組唑阿 侖膠 組湯 加 減組0.0 0 01.2——80+.0 0 12 8 . 0 333 3318236 81071.....84846 26367±±±±±24333 93692.....36444 59267 ?## 111 18109 83681.....15225 53158±±±±±21222 86533.....52685 67532 ?## 31322 52597.....31744 45583±±±±±85876.....57182 12926 ?### 10 4877.....23981 68643±±±±±42323.....60711 24256 ?### 11111 60654 30068.....70941 55254±±±±±42333 14712.....60579 93614?##

        3.2 對GAD、GS 蛋白表達的影響 圖1、表2 顯示,與空白組比較,模型組GAD 蛋白表達顯著降低(P<0.05),GS 蛋白表達顯著升高(P<0.05);與模型組比較,聯(lián)合組、艾司唑侖組、黃連阿膠湯加減組前者蛋白表達(除黃連阿膠湯加減組下丘腦外) 顯著升高(P<0.05),后者蛋白表達顯著降低(P<0.05)。

        3.3 對大鼠下丘腦中神經(jīng)遞質的影響 表3 顯示,與空白組比較,模型組5-HT、5-HIAA 水平顯著降低(P<0.05),NA、DA 水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,聯(lián)合組、艾司唑侖組、黃連阿膠湯加減組前兩者水平顯著升高(P<0.05),后兩者水平(除艾司唑侖組DA 外) 顯著降低(P<0.05)。

        3.4 對大鼠血漿中神經(jīng)遞質的影響 表4 顯示,與空白組比較,模型組5-HT、5-HIAA 水平顯著降低(P <0.05),NA、DA 水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,聯(lián)合組、艾司唑侖組、黃連阿膠湯加減組前兩者水平(除黃連阿膠湯加減組5-HT 水平、艾司唑侖組5-HIAA 水平外) 顯著升高(P<0.05),后兩者水平(除艾司唑侖組DA 外)顯著降低(P<0.05)。

        圖1 各組GAD、GS 蛋白表達

        表2 對GAD、GS 蛋白表達的影響

        表2 對GAD、GS 蛋白表達的影響

        注:與空白組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

        組別 劑量/(g·kg-1)腦干GAD下丘腦 腦干GS下丘腦空模聯(lián)艾黃白型合司連組組組唑阿 侖膠 組湯 加 減組0.0 0 01.2——80+.0 0 12 8 . 0 00000.....64665 71605 25146 62322±±±±±00000.....00000 85467 62222 21769 ?### 00000.....75765 26077 33815 44462±±±±±00000.....00000 74367 23522 47186 ?## 00000.....56666 98123 52506 38224±±±±±00000.....01000 72687 58229 61868 ?### 00000.....46556 59672 99231 28699±±±±±00000.....00000 69667 25233 93914?###

        表3 對大鼠下丘腦中神經(jīng)遞質的影響

        表3 對大鼠下丘腦中神經(jīng)遞質的影響

        注:與空白組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

        組別 劑量/(g·kg-1) 5-HT/(μg·g-1) NA/(μg·g-1) 5-HIAA/(μg·g-1) DA/(μg·g-1)空模聯(lián)艾黃白型合司連組組組唑阿 侖膠 組湯 加 減組0.0 0 01.2——80+.0 0 12 8 . 0 10100.....15088 84221 59643 94418±±±±±00000.....00000 96886 52564 79129 ?### 01111.....95012 56751 32293 78626±±±±±00000.....01001 92991 55250 69439 ?### 00000.....42433 51178 07653 23317±±±±±00000.....00000 73675 26211 91766 ?### 12111.....50696 16214 94355 19234±±±±±00000.....11111 15245 43510 84476?##

        表4 對血漿中神經(jīng)遞質的影響

        表4 對血漿中神經(jīng)遞質的影響

        注:與空白組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

        組別 劑量/(g·kg-1) 5-HT/(μg·L-1) NA/(μg·L-1) 5-HIAA/(μg·L-1) DA/(μg·L-1)空模聯(lián)艾黃白型合司連組組組唑阿 侖膠 組湯 加 減組0.0 0 01.2——80+.0 0 12 8 . 0 331 3185258.....42585 28223±±±±±76776.....22603 64169 ?## 1 30345 62733 24219.....98728 23192±±±±±24333 92147.....23262 67911 ?### 111 76574.....52217 39762±±±±±32332.....14109 63862 ?## 25343 34193.....51528 26257±±±±±79789.....16427 91242?##

        4 討論

        失眠屬中醫(yī)“不寐”“不瞑” “不得臥” 等范疇[11],認為腦卒中后神經(jīng)支配功能受損,脈絡痹阻,氣血運行不暢,日久化火傷陰,耗傷陰液,陽不交陰,氣機逆亂,上犯于腦,而腦為人體元神之府,元神驚擾時心神失養(yǎng),導致失眠[12]。黃連阿膠湯源自《傷寒論》,由黃連、黃芩、白芍、雞子黃、阿膠組成,用于心腎不足、陰虛火旺較重的心煩失眠,方中黃連瀉心火除煩,配伍黃芩則清火力大;阿膠益腎水,佐芍藥則益水力強;去雞子黃加生地滋陰降火,養(yǎng)血生津,陰生火降而神有所藏,而加當歸補血活血,滋陰潤燥,血足血行而神有所屬;阿膠滋陰補血,滋腎陰以養(yǎng)氣血,為潤燥良品,加少許黃芪補氣升陽, “養(yǎng)靜”之陰藥中加入“走動” 之陽藥,行而不滯,陽中求陰,共奏滋陰養(yǎng)血、寧心安神之效。

        5-HT 又稱血清素,是廣泛存在于哺乳動物組織細胞中的抑制性單胺類神經(jīng)遞質,作為可產(chǎn)生愉悅情緒的信使,它幾乎影響到大腦皮層感受的每一向功能,從調節(jié)心情、判斷力、記憶力到塑造人生觀,主要分布于下丘腦與松果體,可參與痛感、睡眠等生理活動的調節(jié)[13],中樞神經(jīng)系統(tǒng)中其水平降低可導致偏頭痛、失眠、抑郁等多種疾病發(fā)生,在外源性刺激作用下5-HT 釋放、分布到血液中,主要被血小板攝取、儲存,儲存量占機體8%左右;5-HIAA 是5-HT 代謝最終產(chǎn)物,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)調節(jié)中具有重要作用[14],精神病、腦功能障礙、睡眠障礙、苯酮尿癥患者其水平減少;NA 是一種維持生命活動的重要神經(jīng)遞質,腦組織中它主要來自交感節(jié)后神經(jīng)元與腦內腎上腺素能神經(jīng)末梢,循環(huán)血液中的主要由其腎上腺髓質合成和分泌[15],可收縮血管,導致血壓上升,增加冠狀動脈血流量,同時可增強心肌收縮力,導致血供減少,缺血加重,擴大梗死范圍;DA 是由腦組織分泌的一種神經(jīng)傳導遞質,負責大腦皮層感覺、情緒信息傳遞,它作用于腦組織神經(jīng)系統(tǒng),可提高記憶力,在睡眠和覺醒中發(fā)揮重要作用[16],其水平降低會導致控制肌肉能力下降,直接影響人們情緒。本實驗發(fā)現(xiàn),艾司唑侖聯(lián)合黃連阿膠湯加減可有效改善腦卒中后失眠血虧陰證大鼠睡眠狀況,其作用機制可能為升高下丘腦和血漿中5-HT、5-HIAA 水平,降低NA、DA 水平,從而改善腦部組織微循環(huán),修復受損神經(jīng)功能,松弛肌肉,擴張血管,增加腦組織供血供氧量,調節(jié)心情。

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