梁 悅， 李 波?， 劉 濤， 張文文， 張 佳， 段鴻英

（1.成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都610052；2.成都大學(xué)，四川 成都610106）

生脈注射液是以李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》 中生脈散為基本復(fù)方制成的注射液，處方中有紅參、麥冬、五味子3味藥材，原研企業(yè)為四川醫(yī)學(xué)院制藥廠，即現(xiàn)在的川大華西藥業(yè)股份有限公司。其功能主治為益氣養(yǎng)陰、復(fù)脈固脫［1］，是國家中醫(yī)藥管理局1995 年公布的中醫(yī)醫(yī)院急診科（室） 必備中成藥之一，應(yīng)用廣泛。目前，全國共有8 家企業(yè)擁有生脈注射液生產(chǎn)批文，但由于各廠家生產(chǎn)工藝參數(shù)有所差別，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊［2］，即使能滿足現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)要求，內(nèi)在化學(xué)成分也可能存在差異。

近年來，紫外、紅外指紋圖譜在中藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，有著樣品前處理簡單、分析時間短、檢測成本低等特點。其中，前者常用于植物種類的分類判別、相似度評價、質(zhì)量一致性研究等；后者可得到物質(zhì)分子內(nèi)部信息，還能顯示單一或混合物質(zhì)結(jié)構(gòu)特征，在中藥材鑒別、定量、定性分析中有著重要地位［3］。

目前，生脈注射液已建立了多張液相指紋圖譜，但其只能反映某一波長下物質(zhì)的紫外響應(yīng)，因此有一定缺陷，但尚無其紫外、紅外指紋圖譜的報道［4-6］。因此，本實驗建立生脈注射液紫外、紅外指紋圖譜，可從整體上評價該制劑質(zhì)量，也是對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行再評價研究的有益探索。

1 材料

TU-1810PC 型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Spectrum Tow 型紅外光譜儀 （美國Pekin Elmer 公司）；BS-6KH 型電子天平（上海有聲衡器有限公司）；FW-5 型壓片機(jī)（天津博天勝達(dá)科技發(fā)展有限公司）；LD510-2R 型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；100 μL 微量進(jìn)樣器（上海安亭微量進(jìn)樣器廠）；瑪瑙研缽。KBr 為光譜純 （成都市科隆化學(xué)品有限公司， 批號2017042101）；水為怡寶純凈水。生脈注射液基本信息見表1。

表1 生脈注射液基本信息

2 方法與結(jié)果

2.1 紫外指紋圖譜

2.1.1 光譜掃描條件考察 以純化水為空白進(jìn)行基線校零，譜帶寬度2.00 nm，波長范圍190 ～800 nm，光度模式吸光度，掃描間隔考察了0.5、1.0 nm，掃描速度考察了快、中、慢速。當(dāng)掃描間隔為0.5 nm 時，不符合吸收曲線要求；為1.0 nm 時，圖譜為一條光滑曲線，符合相關(guān)要求，由于不同掃描速度所得圖譜一致，而快速掃描可節(jié)約時間，故選擇掃描間隔為1.0 nm，掃描速度為快速。結(jié)果見圖1～2。

圖1 光譜掃描條件（掃描間隔0.5 nm）

圖2 光譜掃描條件（掃描間隔1 nm）

2.1.2 供試品溶液制備 精密移取注射液1 mL 于10 mL量瓶中，純化水稀釋至刻度，搖勻，逐級稀釋，稀釋倍數(shù)10～1 000 倍，即得。按“2.1.1” 項下方法采集紫外光譜，發(fā)現(xiàn)當(dāng)稀釋倍數(shù)為200 倍時吸光度在0～1 之間，故確定其作為最佳稀釋倍數(shù)，即取1 mL 注射液于10 mL量瓶中，再取1 mL 稀釋液于20 mL 量瓶中，加純化水稀釋至刻度。結(jié)果見圖3。

圖3 樣品紫外圖譜（稀釋200 倍）

2.1.3 精密度試驗 取A 廠家注射液（批號17040921），按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項光譜掃描條件下掃描6 次，選擇203、211、218、254 nm 作為特征波長，測得吸光度RSD 分別為0.36%、0.35%、0.29%、0.42%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 取A 廠家注射液（批號17040921），按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、1、2、3、4、5 h 在“2.1.1” 項光譜掃描條件下掃描，選擇203、211、218、254 nm 作為特征波長，測得吸光度RSD 分別為0.65%、0.59%、0.46%、0.31%，表明供試品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗 取A 廠家注射液（批號17040921），按“2.1.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液， 在“2.1.1” 項光譜掃描條件下掃描，選擇203、211、218、254 nm 作為特征波長，測得吸光度RSD 分別為1.21%、1.37%、1.39%、1.61%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 紫外圖譜采集 取A 廠家10 批注射液， 按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項光譜掃描條件下掃描，結(jié)果見圖4。

圖4 10 批注射液紫外疊加圖譜

2.1.7 對照紫外指紋圖譜建立 以A 廠家10 批注射液平均吸光度為對照指紋圖譜吸光度，結(jié)果見圖5。

圖5 10 批注射液對照紫外指紋圖譜

2.1.8 相似度分析［7］通過IBM SPSS statistics 數(shù)據(jù)處理軟件中的Kendall’s tau-b 計算相似度，結(jié)果見表2。由表可知，同一廠家不同批次樣品間質(zhì)量較穩(wěn)定；4 個廠家平均相似度RSD 為1.82%，表明不同廠家間樣品質(zhì)量也較穩(wěn)定。

表2 紫外指紋圖譜相似度

2.2 紅外指紋圖譜

2.2.1 測試條件 精密吸取30 μL 注射液于瑪瑙研缽中，揮干后加入100 mg 溴化鉀，沿同一方向研磨均勻，取適量粉末平鋪于紅外壓片模具中，15 MPa 下壓制2 min，將制備好的樣片置于紅外光譜儀中測定，波數(shù)4 000～450 cm-1。

2.2.2 精密度試驗 取A 廠家注射液（批號17040921），按“2.2.1” 項下方法制備樣片并測定6 次，選擇波數(shù)3 399、2 933、1 639、1 411、1 061 cm-1的峰作為共有峰，測得其RSD 分別為2.27%、 1.58%、 0.63%、 0.48%、0.08%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取A 廠家注射液（批號17040921），按“2.2.1” 項下方法制備樣片，于0、1、2、3、4、5 h測定，選擇波數(shù)3 399、2 933、1 639、1 411、1 061 cm-1的峰作為共有峰， 測得其RSD 分別為2.06%、 1.35%、1.87%、1.55%、1.47，表明供試品片在5 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗 取A 廠家注射液（批號17040921），按“2.2.1” 項下方法平行制備6 份樣片，選擇波數(shù)3 399、2 933、1 639、1 411、1 061 cm-1的峰作為共有峰，測得其RSD 分別為2.64%、2.32%、1.22%、0.90%、0.20%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 紅外光譜采集 取A 廠家10 批注射液， 按“2.2.1” 項下方法制備樣片并采集其紅外圖譜，結(jié)果見圖6。

圖6 10 批注射液紅外疊加圖譜

2.2.6 對照紅外指紋圖譜建立 以A 廠家10 批注射液平均吸收強(qiáng)度為對照指紋圖譜吸收強(qiáng)度，結(jié)果見圖7。

圖7 10 批注射液對照紅外指紋圖譜

2.2.7 相似度分析 通過IBM SPSS statistics 數(shù)據(jù)處理軟件中的Kendall’s tau-b 計算相似度，結(jié)果見表3。由表可知，同一廠家不同批次樣品間質(zhì)量較穩(wěn)定；4 個廠家平均相似度RSD 為15.33%，表明不同廠家樣品間質(zhì)量存在較大差異。

表3 紅外指紋圖譜相似度

3 討論

目前，對中藥整體評價最主要的方式有生物效價評價法、指紋圖譜評價法，由于中藥化學(xué)成分復(fù)雜多樣，具有“整體性” 和“模糊性” 的指紋圖譜已大量應(yīng)用于中藥質(zhì)量評價過程中［8-10］，它可通過HPLC-MS、HPLC、UV、IR、物理參數(shù)等多種方法來構(gòu)建，不同表征手段各有優(yōu)勢。其中，紫外指紋圖譜是基于全波長掃描下的質(zhì)量評價，可同時體現(xiàn)樣品在不同波長下的情況，能反映樣品中不飽和化學(xué)鍵（如雙鍵、三鍵、共軛體系、雜原子成分） 特征規(guī)律信息，由于不同成分體系的紫外吸收曲線具有指紋特征，較單一成分定量測定更能全面反映整體情況，可用于產(chǎn)品質(zhì)量一致性評價研究等方面；紅外指紋圖譜反映的是樣品中化學(xué)鍵振動轉(zhuǎn)動而產(chǎn)生的特征信息，可看作是多個純物質(zhì)的疊加，信息量豐富，具有特征性和指紋性，可輔助紫外指紋圖譜從整體上實現(xiàn)對中藥質(zhì)量的控制［11-15］。

本實驗中收集到的生脈注射液按照現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)通過出廠檢驗，均為合格產(chǎn)品，檢驗結(jié)果未見顯著差異，但同時國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心又不斷接收到關(guān)于其嚴(yán)重不良反應(yīng)、事件病例的報告，由于這些產(chǎn)品均是基于以化學(xué)成分含有量生化實驗檢查為主的標(biāo)準(zhǔn)控制產(chǎn)品質(zhì)量，故現(xiàn)行質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)顯然無法完全控制產(chǎn)品質(zhì)量安全性、穩(wěn)定性、均一性。針對此類問題，本實驗結(jié)合紫外、紅外指紋圖譜來對生脈注射液質(zhì)量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同廠家樣品間相似度差異較大（RSD 高達(dá)15.33%），表明該方法可很好地用于評價其質(zhì)量，而且操作簡單，檢測成本低，分析時間快，是中藥注射劑質(zhì)量控制的一種新方法，值得推廣。

另外，本實驗在建立對照指紋圖譜時，按照中藥注射液再評價技術(shù)指導(dǎo)原則試行版中的相關(guān)規(guī)定選取具有代表性的生脈注射液（市場銷量大、質(zhì)量穩(wěn)定、不良反應(yīng)報道少）。但由于對照指紋圖譜要求樣本量盡可能大，而本實驗收集到的生脈注射液批次較少，故后期將繼續(xù)收集以進(jìn)一步完善。