李陽(yáng)杰， 周 敬

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，藥學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，河南 鄭州451150）

木犀草素是黃酮類化合物，主要存在于白毛夏枯草、金銀花、野菊花等植物中，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保肝等多種藥理作用［1-2］，臨床適用于慢性支氣管炎、支氣管哮喘患者鎮(zhèn)咳、祛痰［3］，但其水溶性和脂溶性均較低［4］，導(dǎo)致藥物吸收存在較大問題［5］。磷脂復(fù)合物是中藥活性成分和磷脂通過氫鍵等分子間作用力結(jié)合形成的不同于原型藥物的一種復(fù)合物，可使中藥活性成分由結(jié)晶狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定型狀態(tài)，從而促進(jìn)吸收，增加口服吸收生物利用度［6-13］，但其在水相中的穩(wěn)定性存在一定問題，故選擇合適給藥形式對(duì)其生物利用度有重大影響［9-10］。孫宇薇等［4］對(duì)木犀草素磷脂復(fù)合物進(jìn)行了初步研究，但復(fù)合率很低，僅約77%；本實(shí)驗(yàn)重新對(duì)處方工藝進(jìn)行研究，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化木犀草素磷脂復(fù)合物制備工藝，并考察該制劑基本性質(zhì)和體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為，以期為其藥效學(xué)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配置DAD 檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司）；DF-101S 型磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；NAI-DCY-12Y 型圓形水浴氮吹儀（上海那艾精密儀器有限公司）；THZ-92A 型恒溫振蕩器（上海翠柳實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；XW-80A 型漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；D8 型X 射線粉末衍射儀（瑞士Bruker 公司）。

1.2 材料 木犀草素對(duì)照品（批號(hào)111520-201605，含有量99.6%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；香葉木素對(duì)照品（批號(hào)P0587，含有量99.4%，上海源葉生物科技有限公司）；卵磷脂（批號(hào)PC-98T，輔必成上海醫(yī)藥科技有限公司）。四氫呋喃為色譜純（德國(guó)Merck 公司）；司盤80（批號(hào)S-20161202，臨沂優(yōu)尼特生物科技有限公司）；正辛醇、鹽酸、高氯酸等（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 動(dòng)物 SD 大鼠，雌雄兼具，體質(zhì)量（300±20） g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2012-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 木犀草素含有量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸二氫鉀（7 ∶3）；檢測(cè)波長(zhǎng)348 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 方法學(xué)考察 精密稱取木犀草素對(duì)照品25.0 mg，置于100.0 mL 量瓶中，加入約70 mL 乙腈超聲溶解，靜置至室溫后定容，即得250.0 μg／mL 貯備液，精密量取適量，進(jìn)一步稀釋成5.0、10.0、25.0、50.0、125.0 μg／mL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（Y） 對(duì)溶液質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行線性回歸，得方程為Y=0.030 6X-0.002 7（r=0.999 8），在5.0～125.0 μg／mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

然后，分別取高（125.0 μg／mL）、中（50.0 μg／mL）、低（5.0 μg／mL） 質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，日內(nèi)精密度RSD 為0.51%、0.32%、0.66%， 日間精密度RSD 為0.67%、 0.52%、0.93%，3 種質(zhì)量濃度溶液的平均加樣回收率分別為100.22%、99.64%、99.40%，RSD 分別為0.71%、0.84%、1.42%，表明該方法穩(wěn)定可靠。

2.2 復(fù)合率測(cè)定 稱取適量木犀草素與大豆卵磷脂在一定條件下進(jìn)行反應(yīng)，即得磷脂復(fù)合物，加入5 mL 二氯甲烷，振蕩溶解，0.22 μm 微孔濾膜過濾除去未參加復(fù)合的木犀草素，收集濾液，除去二氯甲烷，收集固體，并加入5 mL乙腈，稱定質(zhì)量后繼續(xù)振蕩溶解，補(bǔ)加乙腈至振蕩前質(zhì)量，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定參加復(fù)合的木犀草素質(zhì)量，計(jì)算復(fù)合率，公式為復(fù)合率=X1／X0×100%。其中，X1為磷脂復(fù)合物中木犀草素質(zhì)量，X0是木犀草素總質(zhì)量。

2.3 正交試驗(yàn) 采用溶劑揮發(fā)法制備磷脂復(fù)合物。稱取適量木犀草素和大豆卵磷脂，加入四氫呋喃，在一定溫度條件下恒溫?cái)嚢瑁瑴p壓旋蒸，除去有機(jī)溶劑，40 ℃真空干燥箱中過夜干燥，即得，于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，磷脂復(fù)合物復(fù)合率主要受攪拌時(shí)間（A）、攪拌溫度（B）、木犀草素質(zhì)量濃度（C）、木犀草素與大豆卵磷脂比例（D） 影響，故以四者為影響因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，并以復(fù)合率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析

由表可知，因素B 對(duì)復(fù)合率有顯著影響（P＜0.05），而其他3 種因素?zé)o顯著影響 （P ＞0.05）；最優(yōu)工藝為A3B3C2D2，即按1 ∶1.2 比例稱取木犀草素、大豆卵磷脂，加入適量四氫呋喃使前者質(zhì)量濃度為15 mg／mL，在55 ℃下恒溫?cái)嚢? h，減壓旋蒸除去有機(jī)溶劑，40 ℃真空干燥箱中過夜干燥，復(fù)合率均接近100%。

2.4 X 射線衍射（XRD） 分析 檢測(cè)條件為Cu-Kα 靶，電流40 mA，掃描范圍3°～45°，掃描速度8°／min，結(jié)果見圖1。由圖可知，木犀草素XRD 圖譜有許多晶型峰，以結(jié)晶狀態(tài)存在，可能是因?yàn)槟鞠菟亍⒋蠖孤蚜字瑯O性端發(fā)生了作用，導(dǎo)致磷脂復(fù)合物中兩者特征晶型峰均消失，最終呈現(xiàn)無(wú)定型狀態(tài)，也證明磷脂復(fù)合物制備成功。

圖1 樣品XRD 圖

2.5 溶解性測(cè)定 將過量木犀草素、物理混合物、磷脂復(fù)合物置于三角瓶中，加入蒸餾水（或正辛醇），室溫下磁力攪拌24 h，6 000 r／min 離心15 min，小心吸取上清液，過濾，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算表觀溶解度，結(jié)果見表4。由表可知，磷脂復(fù)合物在水中的表觀溶解度較木犀草素顯著提高（P＜0.01），同時(shí)在正辛醇中也顯著高于在水中（P＜0.01）。

表4 樣品表觀溶解度測(cè)定結(jié)果

表4 樣品表觀溶解度測(cè)定結(jié)果

注：與同一溶劑中木犀草素比較，??P＜0.01；與水中磷脂復(fù)合物比較，##P＜0.01

樣品 水／（μg·mL-1） 正辛醇／（μg·mL-1）木犀草素 53.83±0.42 511.51±3.14物磷理脂混復(fù)合合物物 1 71 03..19 74± ±01..52 57 ?? 4 56 97 01..85 85± ±61.8 4.3 46??##

2.6 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為

2.6.1 灌胃供試液制備 取木犀草素適量，置于含0.5%CMC-Na 的蒸餾水中，超聲分散，配制成15 mg／mL 混懸液，同法配制15 mg／mL（以木犀草素計(jì)） 磷脂復(fù)合物混懸液；取磷脂復(fù)合物適量，加入0.2 mL 司盤80，輕微研磨后置于中鏈甘油三酯中超聲溶解，配制成15 mg／mL（以木犀草素計(jì)） 澄清狀態(tài)的油制劑。

2.6.2 給藥及取血［11］18 只大鼠于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)1 d，禁食不禁水，按30 mg／kg 劑量分別灌胃給予木犀草素混懸液、磷脂復(fù)合物混懸液、磷脂復(fù)合物油制劑，于0.15、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12 h 眼眶取血各約0.3 mL，置于肝素化離心管中，4 000 r／min 離心4 min，分取上層血漿，-20 ℃冰箱中冷凍保存。

2.6.3 樣品處理 精密吸取大鼠血漿樣品100 μL、內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，置于離心管中，加入3 mol／L HCl 溶液100 μL，渦旋混勻后在75 ℃水浴中放置2.5 h，加入5%HClO4溶液150 μL，3.0 mL 乙酸乙酯提取，渦旋15 min，10 000 r／min離心12 min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相于另一空白離心管中，再加入1.0 mL 乙酸乙酯同法提取，合并提取液，氮?dú)獯蹈桑?00 μL 流動(dòng)相復(fù)溶。

2.6.4 內(nèi)標(biāo)溶液制備 精密稱取香葉木素對(duì)照品25.0 mg，置于100 mL 量瓶中， 加入乙腈超聲溶解定容， 得0.25 mg／mL貯備液，精密量取2.0 mL 于50 mL 量瓶中，混勻后定容，質(zhì)量濃度為10 μg／mL，繼續(xù)精密量取1.0 mL于10 mL 量瓶中，混勻后定容，即得（1.0 μg／mL）。

2.6.5 方法學(xué)考察 取“2.1.2” 項(xiàng)下50.0 μg／mL 對(duì)照品溶液，逐步稀釋成25.0、12.5、5.0、1.25、0.25 μg／mL，各取20 μL，加入180 μL 大鼠空白血漿，按“2.6.3” 項(xiàng)下方法處理，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以木犀草素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），木犀草素、內(nèi)標(biāo)峰面積比例為縱坐標(biāo) （Y） 進(jìn)行回歸， 得方程為Y=1.162 2X+11.652 0（r=0.991 3），在25.0～2 500 ng／mL 范圍間呈良好的線性關(guān)系?？瞻籽獫{、 對(duì)照品溶液、 供試品溶液HPLC 色譜圖見圖2，可知血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾木犀草素和內(nèi)標(biāo)色譜峰，方法專屬性良好。

取含25、150、 2 500 ng／mL 木 犀 草 素 的 血 漿， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，3 種質(zhì)量濃度日內(nèi)精密度RSD（n=3） 分別為9.91%、5.32%、6.08%，日間精密度RSD（n=3） 分別為9.17%、8.69%、7.34%；將實(shí)際測(cè)定的質(zhì)量濃度與配制的質(zhì)量濃度比較，測(cè)得平均加樣回收率在88.16%～93.09%之間；以信噪比S／N≥10 為定量限，S／N≥3 為檢測(cè)限，測(cè)得兩者分別為2.5、1.25 ng／mL。

2.6.6 考察方法 繪制血藥濃度-時(shí)間曲線，計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果分別見圖3、表5。由此可知，磷脂復(fù)合物混懸液Cmax、AUC0～t、AUC0～∞與木犀草素混懸液比較均有所提高，但不明顯（P＞0.05）；磷脂復(fù)合物油制劑tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞與磷脂復(fù)合物、木犀草素混懸液比較均顯著升高 （P ＜0.05，P ＜0.01），生物利用度提高2.09 倍。

圖2 木犀草素HPLC 色譜圖

圖3 樣品血藥濃度-時(shí)間曲線

表5 樣品主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

表5 樣品主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

注：與木犀草素混懸液比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與磷脂復(fù)合物混懸液比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

參數(shù) 單位 木犀草素混懸液 磷脂復(fù)合物混懸液 磷脂復(fù)合物油制劑tCmmaxa x ng·m h L-1 61 03..87 07± ±05.5 1.53 4 84 08..85 42± ±02.1 16 7. 87 1 19 15..98 03± ±02.5 35 3.4#Δ 5##ΔΔ AUC0～t ng·mL-1·h 1 809.83±241.61 2 346.24±293.66 3 783.93±371.54##Δ AUC0～∞ ng·mL-1·h 1 970.14±289.04 2 486.62±312.40 3 905.46±411.43##Δ

3 討論

本實(shí)驗(yàn)將制備溶劑四氫呋喃替換了無(wú)水乙醇，同時(shí)提高制備溫度，此時(shí)木犀草素磷脂復(fù)合物復(fù)合率接近100%，高于無(wú)水乙醇中，其原因可能是乙醇分子中有可作為氫鍵給體的-OH 鍵，在一定程度上干擾了藥物與磷脂形成復(fù)合物，導(dǎo)致復(fù)合率相對(duì)較低。木犀草素在血漿中容易與血清白蛋白形成一種結(jié)合物，為了準(zhǔn)確測(cè)定血藥濃度，必須使該成分從結(jié)合態(tài)游離出來，故在進(jìn)行血漿樣品處理時(shí)，依次采用鹽酸、高氯酸對(duì)蛋白進(jìn)行水解沉淀，取得了良好的結(jié)果。

另外，木犀草素磷脂復(fù)合物混懸液Cmax、 AUC0～t、AUC0～∞與木犀草素混懸液比較無(wú)明顯差異，這可能是由于木犀草素與磷脂之間的作用力太弱，導(dǎo)致磷脂復(fù)合物以混懸液形式給藥時(shí)由于水相干擾，使藥物與磷脂發(fā)生了解離；以油制劑形式給藥時(shí)，可避免水相對(duì)其干擾，為順利透膜吸收奠定了基礎(chǔ)。