馬 云， 王堯堯， 管明瑞， 張 玉， 石曉晨， 席曉志， 張 芳， 李 佳， 張永清

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南250355）

忍冬Lonicera japonica Thunb.為忍冬科多年生木質(zhì)藤本植物，可藥用部位多，具有及其重要的藥用價(jià)值，其干燥花蕾或帶初開的花即是著名的常用中藥金銀花［1］。金銀花主要藥理作用包括抗菌、抗炎、抗病毒［2-4］等，臨床多用于呼吸道感染、口腔潰瘍、感冒發(fā)燒、高血脂等疾?。?］，年需求量在2 000 萬公斤以上，屬常用大宗中藥材。金銀花是藥食同源的藥材，在醫(yī)藥、食品、飲品、保健品、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。忍冬花于每年3、4 月份開始孕育，5 份開始采收， 歷時(shí)接近60 d，整個(gè)花期分為花芽分化、花蕾發(fā)育、花朵開放及花朵凋落幾個(gè)階段。2015 年版《中國藥典》規(guī)定金銀花為忍冬科植物忍冬L．japonica 的干燥花蕾或帶初開的花［1］；但是實(shí)際生產(chǎn)過程中由于采收方法、開放花時(shí)間等因素的限制，市場上流通的金銀花藥材并不全為忍冬干燥花蕾或帶初開的花。自古以來，顏色、氣味是傳統(tǒng)中藥材質(zhì)量評價(jià)的重要指標(biāo)，一些現(xiàn)代研究［6-8］也表明，顏色、氣味與藥材活性成分含有量息息相關(guān)。因此，本項(xiàng)目考慮通過系統(tǒng)研究忍冬花發(fā)育期間顏色、氣味的動態(tài)變化，用于確定忍冬花蕾發(fā)育期（成熟度）、保證金銀花藥材質(zhì)量，對促進(jìn)金銀花藥材的合理開發(fā)利用，對推動中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)健康、快速、可持續(xù)地發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。

1 材料

Mettler Toledo LE204E 型、01193-YP601 N 型電子分析天平（廣州市授科儀器科技有限公司）；GLF-04 型密封型手提式粉碎機(jī)（江陰市康和機(jī)械制造有限公司）；BAG-9246A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海市齊欣科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WF30 精密色差儀（深圳微福光電科技有限公司）；FlavourSpec?氣相離子遷移譜聯(lián)用儀（食品風(fēng)味分析與質(zhì)量控制系統(tǒng)， 濟(jì)南海能儀器股份有限公司）。

在山東天華制藥有限公司于山東省平邑縣鄭城鎮(zhèn)建立的金銀花規(guī)范化種植基地，選擇5 年生金銀花植株進(jìn)行采樣。經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定，確認(rèn)采樣植株為忍冬科多年生木質(zhì)藤本植物忍冬Lonicera japonica Thunb.品種系大毛花。2017 年5 月上旬，在種植基地隨機(jī)選定100 個(gè)忍冬植株，根據(jù)發(fā)育程度將忍冬花的發(fā)育分為米蕾期、三青期、二白期、大白期、銀花期、金花期等6 個(gè)不同時(shí)期，見表1。每株分別采集各發(fā)育期花蕾或花100 個(gè)，然后將100 株上各時(shí)期花蕾或花分別置于板篩內(nèi)曬干，置硅膠干燥器中備用。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 顏色測定 使用精密色差儀對金銀花顏色指標(biāo)進(jìn)行測量并記錄。測量條件為光源D65；標(biāo)準(zhǔn)觀察角 度 是10°； 照 明 口 徑Ф50 mm； 掃 描 速 度600 nm／min；波長掃描范圍780 ～380 nm。用色空間法表示數(shù)據(jù)［9］，L?值為明亮度，L?越大越亮，越小越暗；a?值為紅綠色度，a?值越大越偏紅，越小越偏綠；b?值為黃藍(lán)色度，b?值越大越偏藍(lán)，越小越偏黃色。見圖1，并通過計(jì)算得出褐變系數(shù)（BI）［10-11］。取不同生長發(fā)育期忍冬花樣品，粉碎，過40 目篩，取適量粉末放入色差儀粉末測試盒進(jìn)行測量，每個(gè)樣品平行測定10 次。

2.2 氣味測定 精密稱取忍冬花樣品粉末0.5 g，置于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中；45 ℃、500 r／min 下孵化10 min，頂空進(jìn)樣；進(jìn)樣針溫度85 ℃；進(jìn)樣體積500 μL。 5%苯基-甲基聚硅氧烷柱（15 m×0.53 mm，0.5 μm）； 柱 溫 40 ℃； 分 析 時(shí) 間30 min；載氣，高純N2；體積流量初始5 mL／min，保持2 min 后，18 min 內(nèi)升至150 mL／min，保持10 min。IMS 溫度45 ℃。所得樣品的氣相離子遷移譜圖見圖2。

圖1 色空間法示意圖Fig.1 Schematic diagram of color space method

圖2 樣品氣相離子遷移譜圖Fig.2 GC-IMS chromatograms of sample

2.3 數(shù)據(jù)處理 采用Excel、Origin 9.0 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用氣相離子遷移譜聯(lián)用儀控制系統(tǒng)進(jìn)行忍冬花各發(fā)育期圖譜的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括相似度檢驗(yàn)、樣品差異分析、動態(tài)主成分分析、揮發(fā)性有機(jī)物定性分析等。主成分分析［12］是1 種統(tǒng)計(jì)技術(shù)，用于通過將多個(gè)變量轉(zhuǎn)化為少量綜合變量來簡化1 個(gè)復(fù)雜問題，同時(shí)損失很少的信息。

3 結(jié)果與分析

3.1 顏色指標(biāo)變化 圖3 表明，不同發(fā)育期的忍冬花蕾或花的L?值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，大白期最高，為72.86；a?值隨忍冬花蕾的生長發(fā)育，其整體趨勢是逐步升高，但二白期和金花期均有稍下降趨勢，表明這2 個(gè)時(shí)期，花蕾往綠度值方向變化了微量；b?值除金花期稍有下降外，整個(gè)生長發(fā)育期均穩(wěn)步增大；BI 值隨忍冬花蕾或花的生長發(fā)育逐漸升高，金花期稍有下降。

3.2 氣味指標(biāo)變化

圖3 各發(fā)育時(shí)期花顏色指標(biāo)Fig.3 Color indicator of flower samples at various development

3.2.1 相似度分析 對各發(fā)育時(shí)期忍冬花蕾或花樣品氣相離子遷移譜圖進(jìn)行相似度檢驗(yàn)得出，同一樣品相似度達(dá)95%，見圖4A，不同樣品間相似度僅56%，見圖4B，表明氣相離子遷移譜氣味測定試驗(yàn)的可信度及重復(fù)率極高。

3.2.2 樣本間差異分析 不同發(fā)育期的忍冬花蕾或花的揮發(fā)性物質(zhì)之間存在種類和濃度上的差異，而3 個(gè)相同發(fā)育期的忍冬花蕾或花平行樣之間相似度良好，見圖5A。為了進(jìn)一步觀察，可選取一張譜圖作為參比，所有譜圖扣減這張譜圖，扣減后的譜圖中，背景越干凈，表示和參比的相似度越好。圖5B 中以17051906-2（金花期） 作為參比，同樣可以看出不同發(fā)育期的忍冬花蕾或花之間差異很大，而相同發(fā)育期樣品的3 個(gè)平行圖譜之間相似度很高。

圖4 各樣品相似度Fig.4 Similarities of various samples

圖5 不同發(fā)育期忍冬花蕾或花氣相離子遷移譜圖差異分析Fig.5 Difference analysis of GC-IMS of flower samples at various developments

3.2.3 樣本總體差異分析 首先在譜圖上選取信號峰，見圖6，將關(guān)注的峰標(biāo)記起來（下圖僅為示例，選取的峰越多，越能真實(shí)反映樣品信息）；其次，選擇需要對比的6 個(gè)發(fā)育期樣品圖譜，系統(tǒng)將自動生成指紋圖譜，見圖7。表明每種樣品的完整揮發(fā)物信息以及樣品之間揮發(fā)性有機(jī)物的差異及變化；一些酯類成分 （2-甲基丁酸丁酯、異戊酸、異戊醛） 隨忍冬花成熟度的增加，逐漸增多，部分成分從無到有；異丁醇、乙酸丁酯等物質(zhì)隨忍冬花成熟度增加而逐漸降低；另有2-己烯-1-醇和葉醇等物質(zhì)隨著成熟度的增加，濃度逐漸升高又降低。

圖6 氣相離子遷移譜圖譜標(biāo)記示例Fig.6 GC-IMS labeling example

3.2.4 動態(tài)主成分分析 不同發(fā)育期忍冬花氣味數(shù)據(jù)經(jīng)動態(tài)主成分分析，見圖8，表明米蕾期和三青期（1～2 號） 比較接近，可聚為一類，三青期、二白期、大白期、銀花期、金花期（3 ～6 號） 可以很好的分開。

3.2.5 揮發(fā)性有機(jī)物定性 將通過氣相離子遷移譜測得的氣味數(shù)據(jù)與系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫比對，得到確定的21 種成分，結(jié)果見圖9、表2。

4 討論與小結(jié)

由“辨狀論質(zhì)”［13］理論可得，顏色是判斷忍冬花藥材等級的重要依據(jù)［14-15］，表明藥材顏色與其活性成分含有量是存在密切關(guān)系的。不同發(fā)育期忍冬花蕾或花的顏色指標(biāo)中，a?值與多種活性成分呈顯著相關(guān)，表明花蕾顏色越綠，活性成分含有量越高，根據(jù)藥材顏色判斷活性成分含有量是有據(jù)可依的。

圖7 各發(fā)育期樣品總體氣相離子遷移譜指紋圖譜Fig.7 GC-IMS fingerprints of samples at various developments

圖8 各發(fā)育期樣品總體氣相離子遷移譜主成分分析Fig.8 PCA analysis of total GC-IMS of samples at various developments

圖9 樣品氣相離子遷移譜圖成分定位、編號Fig.9 GC-IMS component localization，numbering

現(xiàn)階段， 氣相離子遷移譜多應(yīng)用于食品方面［16］，如豬肉、羊肉、香煙、水果、葡萄酒等食品的風(fēng)味鑒別；本研究將其用于測定不同發(fā)育期忍冬花蕾或花的氣味，發(fā)現(xiàn)相同發(fā)育期樣品的氣味相似度極高，不同發(fā)育期樣品的氣味數(shù)據(jù)存在可分辨差異，相似度、差異檢驗(yàn)等分析均證明此方法可對忍冬花藥材氣味進(jìn)行分析量化；此外，不同發(fā)育期的忍冬花蕾或花揮發(fā)性物質(zhì)存在很大差異，部分成分從有到無，部分成分從無到有，部分成分先增加后降低。但是由于此技術(shù)在中藥材方面應(yīng)用較少，系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫有待進(jìn)一步補(bǔ)充，不能對所有可測得的成分進(jìn)行定性定量分析。

本研究對不同發(fā)育期忍冬花蕾或花的顏色、氣味進(jìn)行研究，拓展了GC-IMS 的應(yīng)用領(lǐng)域。建立不同發(fā)育期忍冬花蕾或花的顏色、氣味的指紋信息模型庫，為忍冬花及其他中藥原料的品種鑒別提供依據(jù)。

表2 氣相離子遷移譜測得揮發(fā)性有機(jī)物Tab.2 Determination of volatile organic compounds by GC-IMS