王東晗， 梁宇飛， 張欣欣， 趙麗艷， 李亞鑫， 張丹參， 張萬明

（河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北省神經(jīng)藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口075000）

刺五加為五加科植物刺五加Acanthopanax seuticosus（Rupr.et Maxim.）Harms 的干燥根、根莖及莖，又名五加參、西伯利亞參，別名刺拐棒、老虎潦、一百針等［1］。刺五加主要分布在我國北方的東三省、河北和山西。其性味辛、溫、微苦，有益氣健脾、補(bǔ)腎安神的功效，常用于治療脾肺氣虛、體虛乏力、食欲不振、肺腎兩虛、久咳虛喘、腎虛腰膝酸痛、心脾不足、失眠多夢［2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明， 刺五加具有抗腫瘤［3-5］、 抗抑郁［6-7］、 抗 疲 勞［8］、 擴(kuò) 張 心 腦 血 管［9］、 免 疫 調(diào)節(jié)［10-11］等作用。于麗云等［12］通過高效液相色譜法測定了不同生長年限、不同環(huán)境、不同部位刺五加中異嗪皮啶的含有量；姚慧敏等［13］采用超高效液相色譜-紫外檢測器同時(shí)測定了野生刺五加中紫丁香苷、綠原酸、刺五加苷E、異嗪皮啶和槲皮素-3-鼠李糖苷的含有量。幾種化學(xué)成分表征中藥質(zhì)量的質(zhì)控方法，無法全面表征中藥材化學(xué)成分群的整體性和復(fù)雜性，難以全面控制刺五加的內(nèi)在質(zhì)量［14］。中藥指紋圖譜立足于中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究，在中藥材及中藥制劑的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)方面應(yīng)用廣泛［15-16］。已有的對刺五加指紋圖譜的研究中［17-18］，所建立的HPLC 指紋圖譜分析時(shí)間長，藥材選用的產(chǎn)地比較少，沒有很好的代表性。本研究收集了24 批刺五加樣品來源于主產(chǎn)地，建立其UPLC 指紋圖譜，共有峰數(shù)目多，分析時(shí)間大大縮短，并對不同產(chǎn)地該藥材進(jìn)行比較，以期明確各產(chǎn)地藥材相似度，為其質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY 超高效液相色譜儀（自動(dòng)進(jìn)樣器，在線脫氣系統(tǒng)，二極管陣列檢測器，Empower3 色譜工作站， 美國Waters 公司）；ME235P 型電子分析天平（1／10 萬，德國Sartorius公司）；UPT-I-60 L 優(yōu)普系列超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）； 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9140AS（寧波江南儀器廠）；GAOKE 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市英峪高科儀器廠）；Sigma4-15 低速冷凍離心機(jī)（美國Sigma 公司）；CY-5000 型數(shù)控超聲波發(fā)生器（寧波新芝儀器有限公司）。

1.2 試藥 異嗪皮啶對照品 （批號(hào)110837-201608，含有量100.0%）、原兒茶酸對照品（批號(hào)110809-201205，含有量99.9%）、綠原酸對照品（批號(hào)110753-201716，含有量99.3%） 均購自中國食品藥品檢定研究院；紫丁香苷對照品（批號(hào)16060805，含有量大于98%，上海安奈德化學(xué)技術(shù)中心）。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。刺五加樣品來源于該藥材主產(chǎn)地黑龍江、吉林、遼寧、河北、山西等地，見表1。經(jīng)河北北方學(xué)院中藥研究所馬淑蘭教授鑒定為正品，刺五加藥材于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥后，中藥粉碎機(jī)粉碎，過3 號(hào)篩，備用。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） -0.3%冰乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～7 min，95%→80%B；7 ～11 min，80%→70%B；11 ～12 min，70%→60%B）；檢測波長為原兒茶酸257 nm、綠原酸324 nm、紫丁香苷267 nm、異嗪皮啶220 nm；體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.2 供試品溶液制備 精密稱定各產(chǎn)地刺五加粉末1 g， 置于錐形瓶中， 加入72%甲醇15 mL，67 ℃超聲（功率560 W） 提取2 次，2 h／次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥，再用10 mL 20%乙醇溶解，備用。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取原兒茶酸、綠原酸、紫丁香苷和異嗪皮啶對照品各適量，用20%乙醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別為118、198、186、98 μg／mL 的溶液，作為貯備液，備用。

2.4 方法學(xué)考察［19］

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密稱定吉林產(chǎn)刺五加藥材粉末適量，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6 針，以紫丁香苷的色譜峰為參照峰，得17 個(gè)共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD 分別小于1.0%、2.0%，表明該儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定吉林產(chǎn)刺五加藥材粉末適量，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下，分別于0、3、6、9、12、15 h 進(jìn)樣2 μL。以紫丁香苷色譜峰為參照峰進(jìn)行測定。17 個(gè)共有峰在15 h 內(nèi)的相對峰面積RSD 小于3.0%，相對保留時(shí)間RSD 小于1.0%，表明供試品溶液在15 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一產(chǎn)地刺五加藥材粉末（產(chǎn)地吉林） 6 份，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以紫丁香苷為參照峰，得到刺五加藥材17 個(gè)共有峰的相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD 分別小于5.0%、1.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜建立［19-20］

2.5.1 共有峰標(biāo)定及參照峰選擇 精密稱取24 批不同產(chǎn)地樣品粉末各1 g，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，提取各產(chǎn)地刺五加335 nm 處的色譜圖，將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012 版） ”，生成指紋圖譜共有模式和對照指紋圖譜，并標(biāo)定共有峰17 個(gè)，見圖1 ～2。精密吸取混合對照品溶液進(jìn)行測定，通過與對照品保留時(shí)間比對，指認(rèn)了指紋圖譜17 個(gè)共有峰中的原兒茶酸（1 號(hào)峰）、綠原酸 （5 號(hào)峰）、紫丁香苷 （6 號(hào)峰）、異嗪皮啶（11 號(hào)峰），見圖3。6 號(hào)峰紫丁香苷峰形好，峰面積穩(wěn)定，分離度較好，且為刺五加中主要藥理活性成分之一，故選定為UPLC 特征圖譜的參照峰。以紫丁香苷為參照峰，計(jì)算17 個(gè)共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果見表2～3。

圖1 24 批樣品UPLC 指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprints of twenty-four batches of samples

表2 24 批樣品共有峰相對保留時(shí)間Tab.2 Relative retention time of common peaks of twenty-four batches of samples

續(xù)表2

表3 24 批樣品共有峰相對峰面積Tab.3 Relative peak areas of common peaks of twenty-four batches of samples

圖2 樣品對照UPLC 指紋圖譜Fig.2 Reference UPLC fingerprint of samples

2.5.2 相似度評(píng)價(jià) 應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件 （2012 版） ” 對24 批樣品UPLC 指紋圖譜進(jìn)行相似性分析，結(jié)果表明，16 批樣品的相似度在0.950 以上，其余8 批相似度小于0.950，表明不同產(chǎn)地間的刺五加具有一定的差異性。見表4。

表4 24 批樣品相似度Tab.4 Similarities of twenty-four batches of samples

2.5.3 聚類分析 以所測24 批樣品中標(biāo)定的共有峰峰面積為變量，運(yùn)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中的離差平方和法進(jìn)行聚類分析，標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)選擇全距從0～1，樣品測度選擇平均歐氏距離，見圖4。結(jié)果表明，24 批樣品被分為4 類，S1、S2、S4、S5、S8、S9、S11、S16 聚為一類；S12、S15、S24 聚為一類；S14 單獨(dú)為一類；其余樣品聚為一類，此結(jié)果與指紋圖譜相似度分析結(jié)果相似。

圖4 24 批樣品聚類樹狀圖Fig.4 Dendrogram of twenty-four batches of samples

3 討論

本研究在樣本收集方面覆蓋了多數(shù)刺五加產(chǎn)地，包括河北、山西、黑龍江、吉林、遼寧等。樣本收集具有地域代表性、收集范圍廣泛，從而確保了刺五加藥材指紋圖譜生成的科學(xué)性。

在單因素考察的基礎(chǔ)上運(yùn)用Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)，以提取時(shí)間、提取溫度和甲醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，進(jìn)行3 因素3 水平響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，最終確定了“2.2” 項(xiàng)下刺五加供試品溶液的制備方法。

在刺五加藥材的指紋圖譜研究中，應(yīng)用光電二極管陣列檢測器比較了在210 ～400 nm 之間不同掃描波長對吸收峰的數(shù)量、強(qiáng)弱及分離情況。結(jié)果表明，在335 nm 檢測波長下，吸收峰數(shù)量多、峰強(qiáng)度大、各色譜峰分布均勻、峰形大小合適、基線平穩(wěn)，可以表達(dá)刺五加各類成分的出峰情況。此外，還比較了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%冰乙酸水、乙腈-0.2%冰乙酸水等不同流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)峰的分離度和峰形。顯示乙腈-0.3%冰乙酸水為流動(dòng)相時(shí)峰的分離度與峰形良好。實(shí)驗(yàn)時(shí)，以梯度洗脫程序運(yùn)行12 min，為確保色譜圖基線的穩(wěn)定，每次進(jìn)樣前用初始流動(dòng)相平衡5 min。

本研究首次對刺五加藥材UPLC 指紋圖譜進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)和聚類分析，標(biāo)定了17 個(gè)共有峰，4個(gè)已確認(rèn)成分；通過對比不同產(chǎn)地刺五加指紋圖譜的相似度發(fā)現(xiàn)，24 批樣品相似度存在一定差異；聚類結(jié)果將24 批樣品分為4 類。分析結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地刺五加藥材受地域影響較大。該方法專屬性強(qiáng)、精密度高、重復(fù)性好，操作簡便，有利于確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定、均一，以期為刺五加的質(zhì)量控制提供指導(dǎo)和依據(jù)。