楊東方， 胡云飛， 蔡翠芳， 姚雪峰， 夏成凱， 王 玲

（1.山西藥科職業(yè)學院，山西 太原030031；2.安徽中醫(yī)藥科學院亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州236800；3.合肥市食品藥品檢驗中心，安徽 合肥230000；4.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥230031）

決明子為豆科植物決明Cassia obtusifolia Linn.或小決明Cassia tora Linn.的干燥成熟種子，以其有明目之功而名之，臨床上用于目赤澀痛、羞明多淚、目暗不明、大便秘結(jié)等癥［1］。廣泛應用于臨床配方、中成藥及保健品生產(chǎn)原料［2］。近年來，隨著貿(mào)易全球化的不斷推進，市場上出現(xiàn)了越來越多的非常規(guī)進口藥（如決明子、甘草等）［3］。這些“洋中藥” 憑借其價格低廉占據(jù)了國內(nèi)中藥材市場半壁河山，由于其基原難以確定［4］，質(zhì)量參差不齊，嚴重影響了決明子等藥材的質(zhì)量穩(wěn)定性，進而難以確保臨床用藥安全、有效。

中藥臨床療效取決于其含有的有效成分（群）特征［5］。決明子中化學成分群因其種屬及產(chǎn)地不同存在不同程度的差異，也勢必會對其臨床療效產(chǎn)生較大影響［6］。本實驗對市售決明子進行調(diào)查，收集決明子藥材樣品22 批，包括其主產(chǎn)區(qū)廣西、河南、安徽等。通過建立決明子特征圖譜，探討其藥材質(zhì)量一致性。并同時測定決明子中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸、橙黃決明素的含有量，初步形成多指標成分綜合評價體系。

相似度分析、主成分分析是目前普遍應用于中藥復雜體系分析的化學計量學方法［7-8］。本研究相似度分析采用國家藥典委員會研發(fā)的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版” 軟件，該軟件運算采用夾角余弦法，能定量地表征各樣品間的相似程度 （或差異性）； 主成分分析采用瑞典Umetrics 公司的SIMCA-P 軟件，提供了主成分分析等模型的有效算法。通過運用化學計量學方法對決明子特征圖譜、含有量測定結(jié)果進行分析，以期為決明子的品質(zhì)鑒定、質(zhì)量評價及規(guī)范市場經(jīng)營提供了科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waterse2695 高效液相色譜 （美國Waters 公司）；Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Waters 公司）；XP26 型分析天平 （百萬分之一， 德國Mettler toledo 公司）；S30H-D78224 型超聲清洗器 （德國 Elma Sonic公司）。

1.2 試劑與試藥 對照品大黃酸（批號110757-201607，含有量99.3%）、 大黃素甲醚 （批號110758-200610，含有量98.6%）、 大黃素 （批號110756-201512，含有量98.7%）、橙黃決明素（批號111900-201605，含有量98.3%）、大黃酚（批號110796-201520，含有量99.2%），均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，美國Tedia有限公司）；乙醇、磷酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水（屈臣氏公司）。

22 批決明子除7 批收集于河南、安徽等產(chǎn)地外，其他樣品購自于安徽亳州、河北安國及當?shù)厮幉氖袌?。本實驗中樣品均由安徽中醫(yī)藥大學周建理教授鑒定均為豆科植物決明Cassia obtusifolia Linn.的干燥成熟種子，信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 供試品溶液制備 取決明子樣品干燥粉末（過3 號篩） 約1.00 g，精密稱定，置50 mL 錐形瓶中，加70%乙醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%乙醇水溶液補足減失質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm 有機濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取橙黃決明素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量（以對照品含有量標示折算），置50 mL 量瓶中，加70%乙醇至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為0.056 6、0.220 0、0.136 0、0.063 0、0.290 0 mg／mL 的混合對照品貯備液。

2.3 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈 （A） -0.05%磷酸（B），梯度洗脫，洗脫程序見表2；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL／min；波長285 nm；進樣量10.0 μL。在上述色譜條件下，色譜圖見圖1。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.5、1、2、5、10 mL 置10 mL 量瓶中，用70%乙醇定容至10 mL，混勻，得到一系列不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液 （B1、 B2、 B3、 B4、B5）。在“2.3” 項色譜條件下進樣，以峰面積為縱坐標（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X） 進行回歸。結(jié)果見表3。

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液（B3）5.0 μL，在“2.3” 項色譜條件下連續(xù)進樣6 次， 測得各化合物峰面積RSD 0.46% ～1.65%，表明該儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取決明子供試品溶液（J7），在“2.3” 項色譜條件下， 分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，測得各化合物峰面積RSD 0.35%～1.89%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批樣品（J7） 粉末6份，分別按“2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，測得各成分含有量平均值RSD 0.22%～0.95%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含有量的J7 樣品約0.5 g，精密稱定，分別精密加入混合對照品貯備液適量，按“2.1” 項下方法平行制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣，計算加樣回收率。得各成分平均回收率95.6%～101.3%，RSD 0.45%～3.62%。

2.5 樣品含有量測定 取22 批樣品，按“2.1”項下方法平行制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣，測定待測化合物的峰面積，根據(jù)對照品的峰面積采用外標法計算各化合物含有量，見表4。

表4 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g）

2.6 化學計量學分析

2.6.1 相似度分析 在各批次決明子藥材色譜中大黃素的色譜峰（3 號） 分離良好，峰面積較大，為所有樣品所共有，所以確定其為參考峰。將決明子樣品色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版” 軟件，建立了決明子的特征圖譜的共有模式圖，確認了25 個共有峰，并對22 批樣品的圖譜進行相似度評價，結(jié)果見圖2、表5。

圖2 22 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of twenty-two batches of samples

2.6.2 主成分分析 將分析數(shù)據(jù)導入SIMCA-P 13.0 版軟件，以決明子中各成分含有量為X 變量，以樣品22 個批次為Y 變量，以樣本成分的含有量為特征值，將數(shù)據(jù)標準化后進行無監(jiān)督的PCA。見圖3，可知不同產(chǎn)地的藥材在主成分空間的分布上有各自的特定區(qū)域，進口（未知） 與越南產(chǎn)在分布上有區(qū)域交叉，河南產(chǎn)與安徽較接近，安徽產(chǎn)又與廣西產(chǎn)較接近，湖北產(chǎn)、湖南產(chǎn)、山東與其他產(chǎn)地較為疏遠，可能是由于受地理、氣候等因素影響，其化學成分的富集也有所不同。

3 討論

3.1 提取條件選擇 本研究對提取方法及溶劑進行了考察，首先探討對決明子樣品前處理是否脫脂，結(jié)果表明不脫脂實驗效果較好。通過對提取方法與溶劑進行選擇，結(jié)果表明采用70%乙醇溶液提取效果較好，特征圖譜信息豐富；通過采用同一提取溶劑，同一提取時間，不同的提取方法，結(jié)果表明索氏提取效率略高于超聲提取，考慮經(jīng)濟等因素，采用超聲提取法操作簡便，高效；通過對超聲時間進行了考察，超聲提取30 min 最佳。

表5 22 批樣品相似度Tab.5 Similarities of twenty-two batches of samples

圖3 22 批樣品主成分分析圖Fig.3 PCA plot for twenty-two batches of samples

3.2 色譜條件優(yōu)化 本實驗比較了甲醇、乙腈等不同比例的流動相系統(tǒng)，不同類型的色譜柱，選用乙腈-0.05%磷酸水與Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 能將決明子不同成分色譜峰進行很好的分離。采用二極管陣列檢測器考察190 ～700 nm 不同檢測波長圖譜，綜合考慮到?jīng)Q明子化學成分類型，選擇285 nm 作為檢測波長。

3.3 結(jié)果分析 本實驗建立決明子藥材的特征圖譜和5 個化合物含有量測定方法。結(jié)果表明不同產(chǎn)地樣品特征圖譜大致相同，不同產(chǎn)地決明子所含化學成分大致相同，但部分樣品相似度較低，可能在含有量上有所差別。依據(jù)《HPLC 指紋圖譜建立的技術要求》，相似度應大于0.90，根據(jù)圖5 中相似度評價數(shù)據(jù)是否可以將相似度閾值適當降低（如0.85），有待于進一步研究。對各化合物含有量進行分析，不同產(chǎn)地樣品可以聚集到各自特定的區(qū)域，表明決明子的化學成分與其產(chǎn)地、地理位置等生態(tài)環(huán)境存在一定的相關性。

2015 版《中國藥典》 一部規(guī)定決明子藥材按干燥品計算［9］，藥材中含大黃酚不得少于0.20%、橙黃決明素不得少于0.080%。22 批樣品中橙黃決明素合格15 批，大黃酚合格5 批，兩者均合格僅有3 批，這也證實了目前市場上普遍反映決明子不合格的現(xiàn)狀［10］。相比于其他國家及地區(qū)標準，《中國藥典》 的含有量限定值較高［其中《香港中藥材標準》 （第三冊）［11］僅規(guī)定橙黃決明素不得少于0.017%，《第十五改正日本藥局方》［12］未規(guī)定決明子含有量限值］。如何制定科學、合理的中藥材質(zhì)量標準成為了研究熱點［13-14］，徐風等［15］提出中藥藥效物質(zhì)的“顯效形式” “疊加作用” “毒性分散效應” 假說，中藥藥效可能是一類化合物的共同作用效果，決明子中含有眾多蒽醌類化合物，除橙黃決明素、大黃酚外，還有大黃素、大黃素甲醚等，因而決明子未來質(zhì)量標準修訂是否可以總蒽醌量作為評價指標，將有待進一步研究。

本實驗對市售決明子的質(zhì)量現(xiàn)狀進行初步研究，發(fā)現(xiàn)市售決明子來源廣泛，質(zhì)量良莠不齊，進口決明子已成為臨床用藥的重要組成部分，部分進口藥材質(zhì)量較差甚至難以確定其產(chǎn)地，這也給市場監(jiān)管提出了挑戰(zhàn)。本研究建立了特征圖譜、多指標含有量測定的分析方法，為進一步完善決明子的質(zhì)量標準提供了科學依據(jù)。

致謝本研究得到了安徽中醫(yī)藥大學周建理教授、亳州學院盧寶偉副教授的大力支持與幫助。