洪雅丹, 張凌風(fēng), 潘娉娉, 駱 媱, 章建華, 尹 華?
(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究實驗室,浙江 杭州311402;2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,浙江 杭州310006)
淫羊藿、骨碎補為臨床常用的補腎、活血中藥,中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論認(rèn)為腎藏精,主骨;骨痛筋攣,血脈凝澀,臨床和實驗研究常用來配伍治療[1-3]。淫羊藿屬補陽藥,以補腎陽,強筋骨見長;骨碎補屬活血藥,以活血療傷止痛、補腎強骨見長,兩者配伍,既補腎強骨,又活血止痛[4-7]?,F(xiàn)有文獻中,尚未報道有關(guān)淫羊藿-骨碎補藥對的多成分含有量測定。本研究首次建立HPLC 法同時測定淫羊藿-骨碎補藥對中朝藿定A、新北美圣草苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ的含有量,可用于其質(zhì)量控制;結(jié)合配伍對7 種成分溶出的影響,為淫羊藿-骨碎補藥對的配伍機制、配伍對其藥效作用的影響等后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
Waters e2695-2998 高效液相色譜儀 (美國Waters公司);XS105DU 電子天平(十萬分之一,瑞士Mettler 集團);BS110S 電子天平(萬分之一,德國Sartorious 集團);Centrifuge 5804R 冷凍離心機(德國Eppendorf 公司);PHS-3TC 精密數(shù)顯酸度計(上海天達儀器有限公司);KQ5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
淫羊藿飲片分別購于慈溪附海鎮(zhèn)衛(wèi)生院(批號1703015)、 浙江天道醫(yī)藥有限公司 (批號170501)、 浙 江 中 醫(yī) 藥 大 學(xué) 名 中 醫(yī) 館 (批 號171126);骨碎補飲片分別購于浙江天道醫(yī)藥有限公司(批號170401)、慈溪附海鎮(zhèn)衛(wèi)生院(批號161227)、富陽骨傷醫(yī)院(批號1607056),經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張如松教授鑒定為正品;淫羊藿為甘肅小檗科植物柔毛淫羊藿,骨碎補為廣西水龍骨科植物槲蕨,符合2015 年版《中國藥典》 (一部) 項下規(guī)定。柚皮苷(批號110722-200309) 對照品購自中國食品藥品檢定研究院;淫羊藿苷(含有量>98%, B21576)、 朝藿定A (含有量>98%,批號AYY90228) 對照品購自上海源葉生物科技有限公司;朝藿定B (含有量>98%,批號MUST-17071403)、朝藿定C(含有量>98%,批號MUST-17080705)、寶藿苷Ⅰ(含有量>98%,批號MUST-17042203) 對照品購自成都曼斯特生物科技有限公司;新北美圣草苷(含有量>98%,批號CHB171221) 對照品購自成都克洛瑪生物科技有限公司。 甲醇、 乙腈均為色譜純 (德國Merck 公司);水為純凈水(杭州娃哈哈集團);其余試劑均為分析純。
2.1 溶液制備
2.1.1 對照品溶液制備 分別取朝藿定A、新北美圣草苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ對照品適量,精密稱定,加甲醇配成質(zhì)量 濃 度 分 別 為1.997、 2.829、 2.374、 2.199、2.029、2.268、1.925 mg/mL 的對照品貯備液。再分別精密吸取朝藿定A 10 μL、朝藿定B 11 μL、朝藿定C 13 μL、淫羊藿苷31 μL、寶藿苷Ⅰ7 μL、新北美圣草苷47 μL、柚皮苷71 μL 于1 mL 棕量瓶中,定容,搖勻,配制成含朝藿定A 19.97 μg、朝藿定B 24.20 μg、朝藿定C 26.37 μg、淫羊藿苷71.23 μg、 寶藿苷Ⅰ13.61 μg、 新北美圣草苷133.0 μg、柚皮苷169.0 μg 的混合對照品溶液。
2.1.2 供試品溶液制備 取淫羊藿(50 目)、骨碎補(40 目) 飲片粉末各0.2 g,精密稱定,加60%乙醇20 mL,稱定質(zhì)量,90 ℃水浴回流45 min,冷卻至室溫,溶劑補足減失質(zhì)量,續(xù)濾液于4 ℃、12 000 r/min離心15 min,取上清液,即得。
2.1.3 對照溶液制備 分別取淫羊藿(50 目)、骨碎補(40 目) 飲片粉末,按“2.1.2” 項下方法制成淫羊藿、骨碎補單藥對照溶液。
2.2 色譜條件 Waters X Bridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相乙腈 (A) -0.1%磷酸 (B) 體系, 梯度洗脫 (0 ~13 min,17%A;13 ~14 min,17%~19%A;14 ~21 min,19%A;21 ~22 min,19%~23%A;22 ~48 min,23%A;48 ~49 min,23%~44%A;49 ~60 min,44%A;60 ~62 min,44%~90%A); 體積流量1.0 mL/min;柱溫25 ℃;波長280 nm;進樣量10 μL。上述色譜條件下,各檢測成分均達到基線分離,理論塔板數(shù)均大于2 000。
2.3 專屬性試驗 取混合對照品溶液、淫羊藿-骨碎補藥對供試品溶液及淫羊藿對照液和骨碎補對照液,在“2.2” 項條件下進樣,得相應(yīng)色譜圖,見圖1。在與7 個對照品相應(yīng)的位置上,淫羊藿-骨碎補藥對供試品均有相同保留時間的色譜峰;骨碎補對照樣品無朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ色譜峰;淫羊藿對照樣品無新北美圣草苷、柚皮苷色譜峰。
圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents
2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取朝藿定A、新北美圣草苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ各對照品貯備液適量于2 mL 棕量瓶中,加甲醇定容, 搖勻, 制備質(zhì)量濃度分別為88.46、 293.9、 432.0、 122.5、 124.6、 258.9、36.08 μg/mL 的混合對照品溶液,加甲醇稀釋成6個質(zhì)量濃度的對照品溶液,在“2.2” 項條件下分別進樣10 μL,以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y),進行回歸,見表1。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents
2.5 精密度試驗 取“2.1.1” 項混合對照液,在“2.2” 項色譜條件下連續(xù)重復(fù)進樣6 次,測得朝藿定A、新北美圣草苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ峰面積RSD 分別為0.63%、0.13%、0.15%、0.25%、0.47%、0.35%、0.39%,表明儀器精密度良好。
2.6 穩(wěn)定性試驗 取淫羊藿-骨碎補供試品溶液,在“2.2” 項色譜條件下, 分別于0、2、4、8、12、24、48 h 進樣,測得朝藿定A、新北美圣草苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ峰面積RSD 分別為0.91%、0.32%、0.59%、0.91%、0.95%、0.37%、0.72%,表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.7 重復(fù)性試驗 平行取淫羊藿(170501)、骨碎補(170401) 飲片粉末各6 份,按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.2” 項色譜條件下以外標(biāo)兩點法進樣,得朝藿定A、新北美圣草苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ平 均 含 有 量 分 別 為 3.282、 15.20、 11.63、4.183、3.620、10.17、1.397 mg/g,含有量RSD分 別 為 1.3%、 1.6%、 2.0%、 1.8%、 1.1%、1.7%、1.1%,表明該方法重復(fù)性良好。
2.8 加樣回收率試驗 取已測含有量的淫羊藿(170501)、骨碎補(170401) 飲片6 份,每份各約0.1 g,精密加入等同于樣品含有量的各對照品貯備液,按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.2” 項色譜條件下進樣測定,計算回收率,結(jié)果見表2。
表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of recovery tests for various constituents(n=6)
2.9 樣品含有量測定 取3 批淫羊藿、骨碎補飲片,按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.2” 項色譜條件下進樣測定,以外標(biāo)兩點法計算樣品中7 種成分含有量,結(jié)果見表3。采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析,發(fā)現(xiàn)配伍后各成分含有量變化趨勢不明顯(P>0.05)。
表3 各成分含有量測定結(jié)果(mg/g,n=3)Tab.3 Results of content determination of various constituents(mg/g,n=3)
3.1 指標(biāo)成分確定 2015 年版《中國藥典》[5]將淫羊藿苷作為淫羊藿藥材的指標(biāo)成分,又將淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ作為飲片的指標(biāo)成分,但朝藿定A、B、C 等黃酮類成分,也具有增加骨密度、促進成骨細胞分化、抗骨質(zhì)疏松等作用,常作為含有量測定指標(biāo)[8-9]。 《中國藥典》 以柚皮苷作為骨碎補藥材指標(biāo)成分,但其所含的新北美圣草苷也可增強成骨細胞活性、減少破骨細胞形成,具有較強生理活性[10-13]。因此,本研究選擇該7 種成分作為淫羊藿-骨碎補藥對的質(zhì)量分析指標(biāo)。
3.2 色譜條件優(yōu)化 本研究以7 種成分色譜峰的分離度、分析時間及峰形為評價指標(biāo),考察了流動相體系(甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水) 和柱溫(20、25、30 ℃),結(jié)果確定為25 ℃、乙腈-0.1%磷酸水。 采用DAD 檢測器在200 ~400 nm進行光譜掃描,得相應(yīng)圖譜,朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ最大吸收波長為270 nm,新北美圣草苷、柚皮苷最大吸收波長283 nm。表明280 nm 波長下,7 種成分均有較好的靈敏度,雜峰干擾較小,故確定其為檢測波長。
3.3 處理方法選擇 本研究考察了不同提取方法(回流、超聲)、溶劑[45%、60%、75%甲醇(乙醇) 溶液]、提取時間 (30、45、60 min) 等條件,結(jié)果表明60%乙醇回流提取45 min。比較不同溶劑倍量對各成分含有量的影響,表明以100 倍溶劑提取時,各成分提取完全且含有量穩(wěn)定。最終確定了淫羊藿-骨碎補藥對的供試品溶液前處理工藝。
本研究首次建立了HPLC 法同時測定淫羊藿-骨碎補藥對中7 種成分的含有量,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可用于淫羊藿-骨碎補藥對及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制與評價。淫羊藿-骨碎補各成分含有量配伍前后沒有明顯變化,配伍對淫羊藿-骨碎補活性成分的溶出無明顯影響。結(jié)合配伍后各成分含有量的變化趨勢,為淫羊藿-骨碎補藥對配伍對化學(xué)成分溶出、對藥效的影響以及配伍機制等后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。