王慧娜， 尹志峰， 尹 鑫， 李洪波， 趙桂琴?

（1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德067000；2. 承德市農(nóng)林科學(xué)院，河北 承德067000）

金絲草為禾本科金發(fā)草屬植物金絲草Pogonatherum crinitum（Thunb.）Kunth 的干燥全草，味微苦、性寒，無毒，具有清熱解毒、涼血止血、解暑利尿等功效，民間用于治療感冒高熱、尿路感染、黃疸型肝炎和糖尿病等癥。研究表明，金絲草提取物對小鼠肝損傷有一定保護(hù)作用［1］，可劑量依賴性的抑制乙型肝炎病毒（HBV） 分泌表面抗原（HBsAg）［2］。目前從金絲草中分離得到的化學(xué)成分主要為黃酮、甾體及酚酸類［3］。

為闡明金絲草抗HBV 藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，尋找抗HBV 活性天然化合物，本課題組采用活性追蹤方法，對金絲草70%乙醇提取物的活性部位開展了分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及活性評價(jià)工作［4-6］。本研究從正丁醇活性部位分離得到的8 個(gè)化合物，所有化合物均為首次從金發(fā)草屬植物中分離得到，化合物6 對HepG2.2.15 細(xì)胞分泌表面抗原（HBsAg） 及e 抗原（HBeAg） 有一定的抑制作用，IC50分別為55.5、69.5 μg／mL。

1 材料

VG Zabspec 高分辨磁質(zhì)譜儀（英國Micromass公司）；WNMR-1-500 超導(dǎo)核磁共振儀（TMS 為內(nèi)標(biāo)，武漢中科波譜技術(shù)有限公司）；RZ-6 型冷凍干燥機(jī)（德國Martin Christ 公司）；LC-10 A 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；X-4 型顯微熔點(diǎn)測定儀（河南豫華儀器有限公司）；GZX-9070MBE 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DNM-9602 型酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；RE-52B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；二氧化碳孵箱（美國Forma 公司）；SQP 124-1CN 型電子分析天平（德國Sartorius公司）。

Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare 公司）；柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；AB-8 大孔吸附樹脂（南開大學(xué)化工廠）。HBeAg ELISA 檢測試劑盒（北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司）；HBsAg ELISA 檢測試劑盒（北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；胎牛血清（杭州四季青試劑有限公司）；噻唑藍(lán)（MTT，美國Amresco 公司）；拉米夫定（3TC，美國葛蘭素史克公司，批號K026520，含有量＞99%）；色譜純甲醇（北京邁瑞達(dá)公司）。HepG2.2.15 細(xì)胞株由美國Mount Sinai 醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院引進(jìn)饋贈(zèng)，自行傳代培養(yǎng)。

金絲草藥材2016 年12 月購于河北安國藥材交易中心，經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所生藥學(xué)博士李彬鑒定為禾本科金發(fā)草屬植物金絲草Pogonatherum crinitum（Thunb.）Kunth 的干燥全草，樣品標(biāo)本（JSC201612） 保存于承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所。

2 提取與分離

金絲草干燥全草20 kg，用8 倍量70%乙醇回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏4.2 kg。浸膏依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯及水飽和正丁醇萃取，分別得石油醚部位（24 g）、氯仿部位（165 g）、乙酸乙酯部位（121 g）、正丁醇部位（260 g） 及水層浸膏。

正丁醇部位經(jīng)大孔樹脂柱色譜，依次用水，30%、60%、95%乙醇洗脫。60%乙醇洗脫物63 g用硅膠柱色譜分離，分別用氯仿-甲醇（20 ∶1、10 ∶1、5 ∶1） 及氯仿-甲醇-水（90 ∶35 ∶6、60 ∶35 ∶10） 梯度洗脫，薄層色譜同步檢測，合并相似組分得Fr.A～E 5 個(gè)部分。

取Fr.B 部位5.6 g，甲醇溶解，硅膠拌樣后干法上柱，經(jīng)硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（20 ∶1、10 ∶1、5 ∶1） 梯度洗脫，薄層色譜同步檢測，合并相似組分得Fr.B2A ～B2D 4 個(gè)部分。Fr.B2A 部分經(jīng)Sephadex LH-20 柱 （氯仿-甲醇，1 ∶1） 分離，重結(jié)晶法 （甲醇-水） 純化， 得化合物6（13.7 mg）。取Fr.C 部位6.1 g，甲醇溶解，硅膠拌樣后干法上柱，經(jīng)硅膠柱，氯仿-甲醇-水（20 ∶1、10 ∶1、5 ∶1） 梯度洗脫， 合并相似組分得Fr.C2A ～C2E 5 個(gè)部分。Fr.C2A 部分經(jīng)Sephadex LH-20 柱（氯仿-甲醇，1 ∶1） 反復(fù)分離純化，得化合物7（22.6 mg）。Fr.D 部位4.2 g，經(jīng)聚酰胺柱色譜分離，乙醇-水（1 ∶4、1 ∶1、7 ∶3） 梯度洗脫，合并相似組分得Fr.D2A ～D2D 4 個(gè)部分，F(xiàn)r.D2B 部分經(jīng)反復(fù)聚酰胺柱色譜，乙醇-水（1 ∶1） 洗脫，結(jié)合半制備HPLC 純化， 得化合物1（10.1 mg）、5（11.9 mg）。Fr.E 部位3.1 g，經(jīng)硅膠柱色譜反復(fù)分離，氯仿-甲醇-水（90 ∶35 ∶6、60 ∶35 ∶10） 洗脫，Sephadex LH-20 純化，甲醇-水（55 ∶45） 洗脫，得化合物3 （10.8 mg）、4（13.7 mg）。95%乙醇洗脫物33 g 經(jīng)硅膠柱，氯仿-甲醇 （20 ∶1、10 ∶1、5 ∶1） 及氯仿-甲醇-水（90 ∶35 ∶6、60 ∶35 ∶10） 梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢測后合并相同組分，得Fr.F～I(xiàn) 5 個(gè)部分，F(xiàn)r.G 部分3.5 g，經(jīng)硅膠柱，氯仿-甲醇-水（90 ∶35 ∶6、60 ∶35 ∶10）洗脫，重結(jié)晶法（氯仿-甲醇，1 ∶1）純化，得化合物2（13.1 mg）、8（8.8 mg）

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末，mp 263 ～265 ℃，ESIMS m／z：593［M+H］-，分子式為C28H32O14。1HNMR（DMSO-d6， 400 MHz） δ： 12.92 （1H， s，5-OH），8.02 （2H， d， J=8.8 Hz， H-2′， 6′），7.15 （2H， d， J = 8.8 Hz， H-3′， 5′）， 6.97（1H，s，H-3），6.80（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.80（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.80（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），5.05（1H，d，J=7.2 Hz，H-1″）， 4.52 （1H， d， J=2.2 Hz， H-1?）， 3.88（3H， s， H-OCH3），1.05 （3H， d， J=6.2 Hz，H-6?）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz） δ：181.3（C-4），163.1（C-2），162.4 （C-7），162.0 （C-9），160.6（C-4′），156.5 （C-5），128.1 （C-2′，6′）， 122.0 （C-1′）， 114.4 （C-3′， 5′）， 105.1（C-10），100.1（C-1?），99.5（C-1″），99.2（C-6）， 94.1 （C-8）， 75.8 （C-3″）， 75.2 （C-5″），72.6（C-2″），71.6（C-4?），70.2（C-3?），69.9（C-2?），69.1 （C-4″），67.6 （C-5?），65.6 （C-6″），55.3（C-OCH3），17.1（C-6?）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］ 基本一致，故鑒定為5-羥基-4′-甲氧基黃酮-7-O-蕓香糖苷。

化合物2：黃色針晶（氯仿-甲醇），mp 189 ～191 ℃， ESI-MS m／z：289［M+H］+， 分子式為C15H12O6。1H-NMR（CDCl3， 400 MHz） δ： 13.11（1H，s，1-OH），7.36（1H，d，J=10.0 Hz，H-6）， 7.13 （1H， d， J=10.0 Hz， H-5）， 6.35（1H，d，J=2.0 Hz， H-4），6.30 （1H， d， J=2.0 Hz， H-2）， 5.93 （1H， brs， 7-OH）， 4.07（3H，s，8-OCH3），3.86（3H，s，3-OCH3）；13CNMR（CDCl3， 100 MHz） δ： 180.5 （C-CO），166.3 （C-8）， 163.1 （C-7）， 157.1 （C-1），150.1 （C-3）， 145.7 （C-4a）， 144.1 （C-4b），122.3 （C-6）， 114.7 （C-8a）， 113.5 （C-5），103.9（C-8b），96.8 （C-2），92.4 （C-4），62.4（C-8-OCH3），55.6 （C-3-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］ 基本一致，故鑒定為1，7-二羥基-3，8-二甲氧基呫噸酮。

化合物3：黃色粉末，mp 181 ～183 ℃，ESIMS m／z：577［M-H］+， 分子式為C30H26O12。1HNMR（DMSO-d6， 600 MHz） δ： 12.98 （1H， s，5-OH）， 10.35 （1H， brs， 4′-OH）， 9.96 （1H，brs，4?-OH），7.91 （2H， d， J=9.0 Hz， H-2′，6′），7.45 （1H， d， J=16.2 Hz， H-7?）， 7.37（2H，d，J=8.4 Hz，H-2?，6?），6.89（2H，d，J=9.0 Hz， H-3′， 5′）， 6.80 （1H， s， H-3），6.78（1H，d，J=2.4 Hz，H-8），6.64（2H，d，J=8.4 Hz， H-3?，5?），6.44 （1H， d， J=2.4 Hz，H-6），6.31 （1H， d， J=16.2 Hz， H-8?），5.11 （1H， d， J = 7.8 Hz， H-1″）； 13C-NMR（DMSO-d6， 150 MHz） δ： 181.7 （C-4）， 166.6（C-9?），164.0（C-7），162.5（C-2），161.1（C-9），160.8 （C-4′）， 159.5 （C-4?）， 156.6 （C-5），144.7 （C-7?）， 130.1 （C-2?， 6?）， 128.4 （C-2′，6′）， 124.7 （C-1?）， 121.0 （C-1′）， 116.2（C-3′，5′），115.8 （C-3?，5?），113.7 （C-8?），105.4 （C-10）， 103.1 （C-3）， 99.4 （C-1″），99.2（C-6）， 94.8 （C-8）， 76.1 （C-3″）， 73.8（C-5″）， 72.9 （C-2″）， 69.7 （C-4″）， 63.3 （C-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］ 基本一致，故鑒定為芹菜素-7-O-β-D-（6″-E-p-香豆?；?-葡萄糖苷。

化合物4：白色粉末，mp 172 ～174 ℃，ESIMS m／z：577［M-H］+， 分子式為C27H30O14。1HNMR（C5D5N，400 MHz） δ：8.21 （1H， s， H-2），8.08（1H，d，J=8.9 Hz，H-5），7.01（1H，d，J=8.9 Hz，H-6），7.40（2H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′）， 6.87 （1H， d， J=8.0 Hz， H-3′，5′），5.14 （1H， d， J=8.0 Hz， H-1″）， 4.96（1H，d，J=7.2，H-1?）；13C-NMR（C5D5N，100 MHz） δ： 175.4 （C-4）， 162.1 （C-7）， 158.3（C-4′），157.6（C-9），153.1（C-2），130.4（C-2′， 6′）， 126.3 （C-1′）， 124.2 （C-3）， 127.5（C-5），115.9 （C-6），104.1 （C-8），119.5 （C-10）， 116.0 （C-3′， 5′）， 101.8 （C-1?）， 101.5（C-1″），78.9 （C-5?），78.5 （C-5″）， 78.2 （C-3?），78.1（C-3″），74.7（C-2″），74.6 （C-2?），71.1 （C-4″， 4?），62.2 （C-6?）， 62.1 （C-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］ 基本一致，故鑒定為大豆素-7，4′-二-O-葡萄糖苷。

化合物5：淡黃色粉末，mp 215～217 ℃，ESIMS m／z：625［M+H］+，分子式為C28H32O16。1HNMR （DMSO-d6， 400 MHz） δ： 7.81 （1H， d，J=2.0 Hz，H-2′），7.51（1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-6′）， 6.85 （1H， d， J=8.4 Hz， H-5′），6.45（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.21（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），5.63（1H，d，J=7.2 Hz，H-1″），4.54 （1H， s， H-1?）， 1.09 （3H， d， J=6.0 Hz， H-6?）；13C-NMR （DMSO-d6，150 MHz）δ：177.4 （C-4）， 164.2 （C-7）， 161.3 （C-5），156.6 （C-2）， 156.6 （C-9）， 149.4 （C-4′），147.0 （C-3′）， 133.1 （C-3）， 122.2 （C-1′），121.1 （C-6′）， 115.4 （C-5′）， 113.3 （C-2′），104.1 （C-10）， 101.2 （C-1″）， 100.9 （C-1?），98.8（C-8）， 93.9 （C-6）， 76.5 （C-2″）， 76.0（C-3″），74.3 （C-5″），71.8 （C-4?）， 70.7 （C-3?），70.6（C-4″），68.4（C-5?），68.4（C-2?），66.9（C-6″），55.8（C-4′-OCH3），17.6（C-6?）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］ 基本一致，故鑒定為5，7，3′-三羥基-4′-甲氧基黃酮-3-O-蕓香糖苷。

化合物6：白色顆粒結(jié)晶（甲醇-水），mp 201～203 ℃， ESI-MS m／z：208［M+H］+， 分子式為C11H13NO3。1H-NMR （DMSO-d6， 600 MHz） δ：12.62（1H， brs， HCOOH），8.14 （1H， d， J=8.0 Hz， H-NH），7.27 （2H， dd， J=7.4， 6.4 Hz，H-3′，5′）， 7.21 （1H， d， J=6.4 Hz， H-4′），7.20（2H，d，J=7.4 Hz，H-2′，6′），4.37（1H，ddd， J=9.0， 8.4， 4.8 Hz， H-2）， 3.01（1H，dd，J=13.0，4.8 Hz，H-3b），2.81（1H，dd，J=13.8，9.0 Hz，H-3a），1.75（3H，s，HCH3）；13C-NMR （DMSO-d6，150 MHz） δ：169.1（C-NHCO），137.0（C-1′），133.1（C-1），129.2（C-3′， 5′）， 128.3 （C-2′， 6′）， 126.4 （C-4′），53.2（C-2），36.5（C-3），22.1（C-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］ 基本一致，故鑒定為N-乙酰苯丙氨酸。

化合物7：黃色油狀液體，ESI-MS m／z：144［M+H］+，分子式為C6H9NO3。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：1.95（3H，m，H-3a），2.11（2H，m， H-3b， 4a）， 2.35 （1H， m， H-4b）， 3.66（3H，s，H-OCH3），4.15（1H，dd，J=9.2，4.0 Hz， H-2）， 7.93 （1H， brs， H-NH）；13C-NMR（DMSO-d6， 150 MHz） δ： 176.7 （C-5）， 173.3（C-1），54.3（C-OCH3），52.3（C-2），29.1（C-4），24.1（C-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］ 基本一致，故鑒定為焦谷氨酸甲酯。

化合物8：白色顆粒結(jié)晶（氯仿-甲醇），mp 101～103 ℃，ESI-MS m／z：189［M+H］+，分子式為C9H16O4。1H-NMR （DMSO-d6， 400 MHz） δ：11.99（2H， s， H-OH）， 2.19 （4H， t， J=7.2 Hz，H-2， 8）， 1.49 （4H， m， H-3， 7）， 1.25（6H，brs，H-4，5，6）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz） δ： 174.5 （C-1）， 33.0 （C-2， 8）， 28.4（C-3， 7）， 24.3 （C-4， 6）。 以 上 數(shù) 據(jù) 與 文 獻(xiàn)［14］ 基本一致，故鑒定為杜鵑花酸。

4 體外抗HBV活性

選取生長良好的HepG2.2.15 細(xì)胞，用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200 μL，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。藥物以適量DMSO 溶解（陽性對照，拉米夫定），DMEM 培養(yǎng)液2 倍稀釋成6 個(gè)質(zhì)量濃度，分別加入到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，培養(yǎng)4 d 后更換相同質(zhì)量濃度藥物培養(yǎng)液，收集用藥后第8 天細(xì)胞培養(yǎng)上清，按HBsAg、HBeAgELISA 檢測試劑盒說明書測定吸光度值，計(jì)算抗原抑制率及半數(shù)抑制濃度（IC50）［15］。MTT 法測試藥物細(xì)胞毒性［16］，計(jì)算細(xì)胞存活率及半數(shù)細(xì)胞毒濃度（CC50）。數(shù)據(jù)用Origin 軟件處理，采用t檢驗(yàn)。見表1。

結(jié)果表明，化合物6 對HepG2.2.15 細(xì)胞分泌表面抗原（HBsAg） 及e 抗原（HBeAg） 均有一定的抑制作用，IC50分別為55.5、69.5 μg／mL，且選擇指數(shù)SI 均大于2。

5 討論

金絲草為金發(fā)草屬植物中可入藥的品種之一，民間可用于治療黃疸型肝炎［17］。在課題組前期研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)針對金絲草70%乙醇提取物的正丁醇萃取部位進(jìn)行抗HBV 活性成分的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及體外活性檢測。共分離得到8 個(gè)單體化合物，其中包括4 個(gè)黃酮苷、1 個(gè)呫噸酮苷元、2個(gè)氨基酸類及1 個(gè)高級脂肪酸。體外活性檢測結(jié)果表明，化合物6 對HepG2.2.15 細(xì)胞分泌HBsAg 及HBeAg 均有一定的劑量依賴性的抑制作用具有一定的深入研究價(jià)值，以期闡明金絲草藥材的藥效物質(zhì)奠定基礎(chǔ)，并為抗HBV 新藥的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

表1 化合物6 的體外抗HBV 活性Tab.1 Anti-HBV activity of compound 6 in vitro

表1 化合物6 的體外抗HBV 活性Tab.1 Anti-HBV activity of compound 6 in vitro

注：IC50為半數(shù)抑制濃度；CC50為半數(shù)細(xì)胞毒濃度；SI 為選擇指數(shù)，CC50／IC50；3TC 為拉米夫定；與0 μg／mL 組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 （質(zhì)μ量g·m濃L度-1／） 抑制率／% IC H 50B／s（Aμg g·mL-1） SI 抑制率／% IC H 50B／e（Aμg g·mL-1） SI CC50／（μg·mL-1）化合物6 100 64.4±0.6??55.5 ＞2 57.2±0.4??69.5 ＞2 ＞150 50 48.7±0.4??43.4±0.8??25 32.3±0.6??32.2±0.9??12.5 19.0±1.0??22.1±0.7??6.3 5.2±0.6??3.7±0.4?3.2 4.8±1.0?-3.0±1.0?0 00 3TC 組 50 61.3±0.5??26.6 - 67.4±2.1??23.2 - -25 54.8±0.9??52.9±0.9??12.5 31.6±0.6??39.9±2.7??6.3 23.1±0.8??14.7±2.4??3.2 10.4±1.2??14.1±0.9??1.6 8.1±1.2??5.6±1.2??0 00