夏雨果， 陳 秋， 高 坪， 曾文彤， 張 闖， 胡臣玲

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院／附屬醫(yī)院泌尿外科，四川 成都610072；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川 成都610072）

勃起功能障礙是糖尿病常見的并發(fā)癥［1］，是影響患者生活質(zhì)量及家庭和諧的重要因素，其發(fā)病機(jī)制不明，缺乏有效的預(yù)防及治療措施。中醫(yī)對(duì)勃起功能障礙有獨(dú)特療效，本實(shí)驗(yàn)研究人參皂苷Rg1對(duì)糖尿病大鼠勃起功能障礙的影響，并探討其作用機(jī)制，為患者治療提供新思路。

1 材料

清潔級(jí)雄性SD 大鼠，約6 ～7 周齡，體質(zhì)量200～350 g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。人參皂苷Rg1（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）；西地那非片 （美國(guó)輝瑞公司）；Trizol （美國(guó)Invitrogen 公司）； 鏈脲佐菌素 （STZ）、 阿撲嗎啡（APO）、焦碳酸二乙酯（DEPC） （美國(guó)Sigma 公司），PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq II Kit［寶生物工程（大連） 有限公司］；實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x（美國(guó)Thermo Fisher 公司），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。大鼠一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶 （SOD）、丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司）；SIRT1、eNOS；β-actin 抗體（美國(guó)Affinity 公司）；濃縮型DAB 試劑盒、羊抗兔二抗（北京中衫金橋生物有限公司）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；蛋白Marker（美國(guó)NEB 公司）；ECL 發(fā)光試劑盒（美國(guó)Thermo公司）；聚偏二氟乙烯（PVDF） 膜（美國(guó)Hybond公司）；大鼠ICP／MAP 測(cè)定采用BL-420 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；免疫組化采圖及分析采用Image-Pro Plus 6.0（美國(guó)Media Cybernetics 公司）。

2 方法

2.1 模型建立 90 只大鼠在SPF 環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后測(cè)定隨機(jī)血糖，作為基線，隨機(jī)選取10只作為正常組，其余80 只作為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)1 型糖尿病，劑量60 mg／kg；正常組大鼠腹腔注射等量生理鹽水以減少實(shí)驗(yàn)誤差，注射后7 d 取尾靜脈血測(cè)定隨機(jī)血糖，以其＞16.7 mmol／L 作為成模標(biāo)準(zhǔn)［2］，未成模者補(bǔ)充注射1 次鏈脲佐菌素，劑量30 mg／kg，注射后3 d再按以上標(biāo)準(zhǔn)篩選模型。糖尿病大鼠飼養(yǎng)10 周后，參照Heaton［3］報(bào)道的方法篩選，將阿撲嗎啡按100 μg／kg 劑量皮下注射于大鼠頸部皮膚，觀察30 min，記錄有無勃起及勃起次數(shù)，未勃起者為勃起功能障礙，勃起標(biāo)準(zhǔn)為龜頭露出充血，包皮后退，陰莖膨大增長(zhǎng)。

2.2 分組及給藥 注射鏈脲佐菌素后4 只大鼠無法誘導(dǎo)成糖尿病，同時(shí)糖尿病大鼠喂養(yǎng)期間死亡7只，最終篩選出56 只。原有正常組不變，將篩選成功的大鼠隨機(jī)分為4 組，每組14 只，分別為正常組、模型組（灌胃等量生理鹽水）、人參皂苷Rg1低劑量組（灌胃15 mg／kg） 和高劑量組（灌胃30 mg／kg）、西地那非組（灌胃5 mg／kg）。給藥2、4 周， 測(cè)定大鼠體質(zhì)量及血糖，4 周后測(cè)定ICP／MAP 以評(píng)估勃起功能，完成后取大鼠陰莖組織，進(jìn)行病理學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)。

2.3 陰莖海綿體內(nèi)壓 （ICP） 及平均頸動(dòng)脈壓（MAP） 測(cè)定 各實(shí)驗(yàn)組大鼠給藥4 周后測(cè)定ICP／MAP，測(cè)定前24 h 停止給藥，測(cè)定當(dāng)天早上禁食，予以10%水合氯醛（3 mL／kg） 麻醉，常規(guī)消毒鋪巾，暴露頸總動(dòng)脈，將22 號(hào)蝶形插管插入頸總動(dòng)脈并固定與生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)以測(cè)定MAP 值；解剖分離陰莖，將24 號(hào)蝶形針插入陰莖海綿體連接傳感器以測(cè)定ICP，再分離出陰莖根部海綿體神經(jīng)，將生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的電極鉤住海綿體神經(jīng)以刺激陰莖勃起，分別測(cè)定基礎(chǔ)、勃起狀態(tài)下最高ICP 值。

2.4 MDA、NO、SOD 水平檢測(cè) 采用ELISA 法。大鼠陰莖組織充分勻漿后， 3 000 r／min 離心15 min，收集上清液，將MDA、NO、SOD 抗體包被于48 孔微孔中制成固相載體，加入對(duì)照品或樣品。MDA、NO、SOD 連接于固相載體上的抗體結(jié)合，徹底洗滌后加入相應(yīng)抗體，將未結(jié)合的生物素抗體洗凈后，加入辣根過氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的親和素，再次徹底洗滌后加入四甲基聯(lián)苯胺底物顯色，它在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化成黃色，顏色深淺與3 種因子水平呈正相關(guān)。然后，在450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。

2.5 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用qPCR 法。將液氮中保存的陰莖組織按說明書用Trizol 提取總RNA 后，依次加入DNA Eraser Buffer、DNA Eraser、RNase Free dH2O，42 ℃下反應(yīng)2 min 以去除基因組DNA，將所得RNA 用PrimeScript RT Enzyme Mix I 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)完成后加入引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 引 物 序 列 為β-actin （正 向5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′，反向5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA） -3′、SIRT1（正向5′-TGGCAGTAACAGTGACAGTGGCACAT-3′， 反 向 5′-TCAGCTCCAGATCCTCCAGCACACTC-3′）， eNOS （正 向5′-AGCTGGATGAAGCCGGTGAC-3′，反向5′-CCTCGTGGTAGCGTTGCTGA-3′）。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃充分延伸并采集熒光30 s，以上反應(yīng)循環(huán)40 次，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

2.6 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 法。取液氮凍存大鼠睪丸組織100 mg，于37 ℃水浴中解凍后按1 ∶10 的比例加入RIPA 裂解液，滅菌后的小剪刀剪碎，碎冰上裂解10 min，收集裂解液并離心，上清液用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將積層膠配制好并加入電泳液，根據(jù)所測(cè)蛋白濃度加入60 μg 蛋白量至樣孔中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后按轉(zhuǎn)膜方法覆蓋PVDF 膜，接通電源調(diào)整至電流至200 mA 轉(zhuǎn)膜1 ～2 h，然后依次封閉，一抗孵育過液，其中一抗?jié)舛劝磂NOS 1 ∶1 000、SIRT1 1 ∶500、β-actin 1 ∶5 000 的比例進(jìn)行稀釋，再進(jìn)行二抗孵育，最后進(jìn)行顯影、定影、拍照。Quentity One 進(jìn)行目的條帶分析，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白積分光密度值（IOD） ／內(nèi)參積分光密度值（IOD）。

2.7 eNOS 陽性細(xì)胞表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。將大鼠陰莖病理切片脫蠟后浸入3%甲醇雙氧水中10 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min，檸檬酸鹽緩沖液加溫至沸騰， PBS 洗凈后加入封閉液浸泡20 min，再加入一抗反應(yīng)過夜，滴加生物素二抗，37 ℃下反應(yīng)30 min，PBS 洗滌3 次后DAB 顯色，透明樹膠封片，光鏡下采圖，通過Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS17.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用（） 表示，2 組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量與血糖 表1 顯示，建模1 周后各組大鼠體質(zhì)量無顯著差異（P＞0.05），同時(shí)也排除了基線誤差；隨著生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)，體質(zhì)量逐漸增加，但正常組更明顯，而在同一時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量均顯著低于正常組（P＜0.01），但組間無顯著差異（P＞0.05）。表2 顯示，注射鏈脲佐菌素后1周實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖顯著高于正常組（P＜0.01），達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)使用人參皂苷Rg1或西地那非后大鼠血糖值均無顯著變化（P＞0.05）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of rat body weights among various groups

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of rat body weights among various groups

注：與正常組比較，??P＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)／只 造模1 周 造模4 周 造模10 周 給藥2 周 給藥4 周正模人人西常型參參地組組皂皂那 苷苷非 組RR gg 11低高劑劑量量組組 11111 04444 22222 34444 95122.....62270 17534±±±±±59565.....36418 16275 32222 95586 05136.....31560 35610±±±±±33354 03765.....75156 86251 ???????? 43332 70009 87317.....38782 98561±±±±±38545 90334.....15169 33126 ????????43222 90878 28241.....96362 43189±±±±±49444 30354.....70855 05938 ???????? 53332 13019 02464.....77983 21492±±±±±48344 10829.....60510 17957????????

表2 各組大鼠血糖比較Tab.2 Comparison of rat blood glucose among various groups

表2 各組大鼠血糖比較Tab.2 Comparison of rat blood glucose among various groups

注：與正常組比較，??P＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)／只 造模1 周 造模4 周 造模10 周 給藥2 周 給藥4 周正模人人西常型參參地組組皂皂那 苷苷非 組RR gg 11低高劑劑量量組組 11111 04444 1211 68087.....36235 72374±±±±±05555.....31839 23304 ????????3323 62191.....57275 97901±±±±±03444.....37341 23140 ???????? 2232 56509.....45107 25135±±±±±08856.....34432 01702 ???????? 2232 58709.....62134 60566±±±±±07825.....44878 06383 ???????? 2322 58066.....74169 63504±±±±±07287.....56808 70898????????

3.2 SOD、MDA、NO 水平 表3 顯示，與正常組比較， 模型組大鼠SOD、 NO 水平顯著降低（P＜0.01），MDA 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，人參皂苷Rg1高劑量組SOD、NO水平顯著升高（P ＜0.05），MDA 水平顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組SOD、MDA、NO 水平比較Tab.3 Comparison of SOD，MDA and NO levels among various groups

表3 各組SOD、MDA、NO 水平比較Tab.3 Comparison of SOD，MDA and NO levels among various groups

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01，；與模型組比較，△P＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)／只 SOD／（ng·mL-1） MDA／（nmol·mL-1） NO／（μmol·mL-1）正模人人西常型參參地組組皂皂那 苷苷非 組RRgg 11 低 高劑劑量量組組 11111 04444 22222.....40130 77349 42666±±±±±00000.....11211 74191 56666 ??△???? 11111.....57656 13266 44020±±±±±00000.....01101 50284 35502 ?△??96677.....34979 91752 00268±±±±±01100.....42098 98783 19872??????△△

3.3 ICP／MAP 表4 顯示，與正常組比較，模型組ICP／MAP 顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，人參皂苷Rg1組ICP／MAP 顯著升高 （P ＜0.05，P＜0.01），以高劑量組更明顯。

表4 各組ICP／MAP 比較（，1 mmHg=0.133 kPa）Tab.4 Comparison of ICP／MAP among various groups（，1 mmHg=0.133 kPa）

表4 各組ICP／MAP 比較（，1 mmHg=0.133 kPa）Tab.4 Comparison of ICP／MAP among various groups（，1 mmHg=0.133 kPa）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)／只 MAP／mmHg 勃起前ICP／mmHg 勃起后ICP／mmHg （ICP／MAP）／%正模人人西常型參參地組組皂皂那 苷苷非 組RRgg 11 低高劑劑量量組組 11111 04444 11111 22222 41244.....39933 6880±±±± ±8 423.6...5.56578 738 9 21111 81123.....85920 2660±±±± ±3 322.3...7.29666 6568?? ?????? 10 3466 65855.....44237 222±±±±±87 126..3..17.7611 685???? ????△△ △△△ 82355 59922.....30147 57978±±±±±72544.....87086 02927????????△△△△ △

3.4 SIRT1、eNOS mRNA 表達(dá) 圖1 顯示，與正常組比較，模型組SIRT1、eNOS mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，人參皂苷Rg1高劑量組兩者mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

圖1 各組SIRT1、eNOS mRNA 表達(dá)Fig.1 mRNA expressions of SIRT1 and eNOS in various groups

3.5 SIRT1、eNOS 蛋白表達(dá) 圖2 顯示，與正常組比較，模型組SIRT1、eNOS 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，人參皂苷Rg1高劑量組兩者蛋白顯著升高，其表達(dá)量顯著高于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 各組SIRT1、eNOS 蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expressions of SIRT1 and eNOS in various groups

3.6 eNOS 分布 圖3 顯示，eNOS 陽性細(xì)胞主要分布于血管周圍內(nèi)皮細(xì)胞，位于細(xì)胞漿；與正常組比較，模型組eNOS 平均光密度值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，人參皂苷Rg1高劑量組其平均光密度值顯著升高（P＜0.05）。

4 討論

勃起功能障礙是指多種原因造成的陰莖海綿體血液充盈不足，導(dǎo)致陰莖持續(xù)不能達(dá)到或維持足夠勃起以完成并維持滿意的性交，是影響眾多男性健康和家庭幸福的常見疾病。隨著生活水平及方式的改變，糖尿病發(fā)病率逐年升高，并且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)， 也成為勃起功能障礙重要原因之一［4-5］，其發(fā)病機(jī)制可能與糖尿病患者在長(zhǎng)期高血糖環(huán)境下引起的氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的ROS、MDA、8-OHdG 等氧化應(yīng)激產(chǎn)物損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，影響內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO 等因子，甚至引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，患者陰莖血管病變導(dǎo)致血管壁彈性纖維的糖基化反應(yīng)，使海綿體竇狀血管舒張能力降低，從而影響陰莖勃起功能［6］。目前，治療糖尿病勃起功能障礙的方法除了控制飲食和血糖外，其余與普通勃起功能障礙類似，主要以經(jīng)典的PDE5 抑制劑（5 型磷酸二酯酶抑制劑） 為主，如他達(dá)那非、西地那非等，此類藥物短期療效較好，但長(zhǎng)期療效不理想，而且其心血管副作用及部分患者憂慮導(dǎo)致接受度不高，故亟需開發(fā)有效的天然藥物。

圖3 各組eNOS 免疫組化分析（IHC×400）Fig.3 Analysis of eNOS immunohistochemistry in various groups（IHC×400）

中醫(yī)認(rèn)為，糖尿病屬中醫(yī)“消渴” 范疇，病久引起陽痿［7］，其成因歷代均主張為腎虛，由此也形成了以治腎為主的辨治理論［8］，而治腎又以腎氣、腎精為著手點(diǎn)，如人參、杜仲、淫羊霍、鹿茸等藥材成為常用中藥。其中，人參味甘、微苦，性微溫，具有益氣補(bǔ)中、生津止渴等功效，被用于治療消渴病，人參皂苷Rg1是其主要有效成分之一，有明顯的抗氧化及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，可降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物生成，提高機(jī)體抗氧化活性，減少糖尿病并發(fā)癥發(fā)生［9］。課題組前期證明，改善陰莖血管內(nèi)皮細(xì)胞功能可保護(hù)勃起功能，將攜帶多效生長(zhǎng)因子（PTN） 基因的脂肪干細(xì)胞注射進(jìn)勃起功能障礙大鼠的陰莖海綿體1 周后，即能檢測(cè)到該基因高表達(dá)，勃起功能得到有效恢復(fù)［10］； 文獻(xiàn)［11］ 報(bào)道，人參皂苷Rg1可通過PI3K-Akt 信號(hào)通路來促進(jìn)eNOS mRNA 表達(dá)，增加NO 生成，從而達(dá)到抗心肌缺血的作用，而且能顯著降低糖尿病大鼠血糖，改善血脂代謝紊亂，提高肝臟及外周組織胰島素敏感性，改善胰島素抵抗［12］；由于該成分常用劑量為10 ～40 mg／kg［13］，故本實(shí)驗(yàn)選擇15、30 mg／kg 進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其劑量越高，對(duì)勃起功能及生化指標(biāo)的改善程度越明顯，雖未對(duì)血糖有明顯影響，但它可明顯減輕氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)陰莖血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)eNOS 產(chǎn)生，增加血管舒張因子NO 的產(chǎn)生，從而改善糖尿病大鼠勃起功能。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1（Sirt1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴性的去乙?；福瑥V泛存在于機(jī)體的各種體細(xì)胞及生殖細(xì)胞中，具有減緩血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老、提高血管內(nèi)皮細(xì)胞功能等作用［14］，可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮源型一氧化氮合酶（eNOS）等活性來促進(jìn)NO 生成，改善內(nèi)皮依賴的血管舒張活性，并延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老［15-16］，故對(duì)以內(nèi)皮功能障礙為主要病因的疾病，特別是勃起功能障礙，它可能是其潛在的治療靶點(diǎn)之一。 Yu等［17］發(fā)現(xiàn)，白黎蘆醇可通過激活Sirt1 基因來改善糖尿病大鼠的勃起功能，其主要機(jī)制是上調(diào)其下游基因eNOS 表達(dá)，使內(nèi)皮細(xì)胞能產(chǎn)生更多NO，舒張陰莖動(dòng)脈，從而增加血流量；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1 也可上調(diào)勃起功能障礙大鼠陰莖組織中該因子表達(dá)，從而激活其下游基因eNOS 表達(dá)。同時(shí)，西地那非雖然能提高eNOS、NO 水平，但對(duì)SIRT1、SOD 水平的提高程度，以及陰莖組織氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用不明顯，表明它主要通過抑制PDE-5 來增加eNOS、NO 生成。另外，勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體部分肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂甚至纖維化，可能也是影響勃起功能的重要因素，這也是今后研究的重點(diǎn)，也需延長(zhǎng)給藥時(shí)間來觀察人參皂苷Rg1對(duì)陰莖組織的影響，并考察其安全性。

綜上所述，人參皂苷Rg1 能有效減輕勃起功能障礙糖尿病大鼠陰莖組織的氧化應(yīng)激損傷，明顯改善勃起功能，其主要作用機(jī)制可能是上調(diào)Sirt1／eNOS 信號(hào)通路，從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。