何國鑫， 鄧青芳， 陳華國， 趙丹妮， 周 欣?

（1.貴州師范大學貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴州 貴陽550001；2.貴州師范大學貴州省藥物質量控制及評價技術工程實驗室，貴州貴陽550001；3.貴州師范大學天然藥物質量控制中心，貴州 貴陽550001）

肝臟是體內新陳代謝的中心站，具有十分重要和復雜的生理功能［1］，易受病原體、有毒物質、免疫病理等影響，流行性醫(yī)學研究表明，肝病的發(fā)病率不斷攀升，嚴重危害人類身體健康和生活質量。肝損傷是各種肝臟疾病共有的一種病理狀態(tài)，其持續(xù)惡化會導致肝硬化、肝纖維化、肝癌等［2］。

杠板歸為多年生蔓生草本蓼科植物杠板歸Polygonum perfoliatum L.的干燥地上部分，具有清熱解毒、利水消腫、保肝、止咳等功效［3］，在治療肝損傷方面有一定功效［4-8］，但肝損傷同時是否會對其上下游器官——心臟和腎臟造成影響尚不清楚。因此，本實驗考察杠板歸乙醇提取物對化學性肝損傷小鼠的保護作用，對于闡明該藥材肝損傷作用機制具有重要意義，也為其深入研究與相關產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 藥材 杠板歸購自貴州省安順市靜寧縣，經(jīng)貴州師范大學陳華國教授鑒定為杠板歸Polygonum perfoliatum L.的干燥全草。

1.2 動物 SPF 級雄性KM 小鼠，體質量18 ～22 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司［許可證號SCXK（湘）2014-0011］。

1.3 試劑 聯(lián)苯雙酯滴丸（浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司，批號A02J151230）；谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA） 試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.4 儀器 萬分之一天平［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司，型號AL204］；酶標儀（美國Moleaular Devices 公司，型號Max Plus 384）；倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電技術有限公司，型號MF53）。

2 方法

2.1 供試藥制備 取1 kg 藥材粉碎，過60 目篩，85%乙醇回流提取3 次，料液比1 ∶8，每次2 h，合并提取液，過濾，減壓蒸餾，濃縮，即得。然后，計算得率并配制成不同質量濃度藥液，貯藏備用。

2.2 分組及給藥 72 只小鼠隨機分為空白組、模型組、聯(lián)苯雙酯滴丸組（150 mg／kg） 及杠板歸乙醇 提 取 物 高、 中、 低 劑 量 組 （1.28、 0.64、0.32 g／kg）。除空白組外，其余各組小鼠均腹腔注射含1%CCl4橄欖油溶液（10 mL／kg） 造模，每3 d1 次。1 周后，各給藥組按照10 mL／kg 劑量灌胃給予相應劑量藥物，空白組、模型組灌胃給予等體積生理鹽水，連續(xù)3 周，同時除空白組外，其余各組繼續(xù)腹腔注射含1%CCl4橄欖油溶液。

2.3 血清AST、ALT 活性測定 末次給藥后，小鼠禁食不禁水16 h，眼球取血，3 500 r／min 離心10 min，取上層血清，-20 ℃下保存，按照試劑盒標準，采用生化法檢測AST、ALT 活性。

2.4 各組織中SOD 活性、MDA 水平測定 小鼠脫臼處死后，迅速解剖取肝臟、心臟、腎臟，冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干表面水分后稱定質量，計算相關臟器指數(shù)，公式為臟器指數(shù)=臟器質量／體質量。在臟器固定位置取各組織約100 mg，洗凈后按1 ∶9 比例加入冰生理鹽水，冰水浴上制成10%組織勻漿，4 ℃、3 500 r／min 離心10 min，取上清，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｈ缓?，考馬斯亮藍法進行蛋白定量，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA） 法檢測SOD活性、MDA 水平。

2.5 組織病理學變化觀察 將剩余小鼠肝臟、心臟、腎臟于10%福爾馬林溶液中固定48 h，經(jīng)過脫 水、 石 蠟 包 埋、 切 片、 脫 蠟、 蘇 木 素-伊 紅（HE） 染色等標準步驟后，制作常規(guī)HE 染色切片，光學顯微鏡下觀察組織病理學變化。

2.6 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間比較采用t 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 杠板歸乙醇提取物對臟器指數(shù)的影響 表1顯示，與空白組比較，模型組臟器指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，除杠板歸乙醇提取物高劑量組心臟指數(shù)外，各給藥組臟器指數(shù)均有所降低，但無顯著差異（P＞0.05）。

表1 杠板歸乙醇提取物對臟器指數(shù)的影響（±s，n=12）Tab.1 Effects of ethanol extract of P．perfoliatum on viscera indices（±s，n=12）

表1 杠板歸乙醇提取物對臟器指數(shù)的影響（±s，n=12）Tab.1 Effects of ethanol extract of P．perfoliatum on viscera indices（±s，n=12）

注：與空白組比較，??P＜0.01

組別 肝臟指數(shù) 心臟指數(shù) 腎臟指數(shù)空模白型組組 34 89..48 38 88± ±39..56 36 75 ?? 45..24 69 69± ±01..51 08 57 ?? 11 15..80 80 42± ±12..92 37 6 1??聯(lián)苯雙酯滴丸組 46.846±6.012 4.960±0.756 14.080±1.417杠板歸乙醇提取物高劑量組 48.425±3.736 5.552±1.032 14.423±1.691杠板歸乙醇提取物中劑量組 46.092±5.669 5.459±0.671 13.355±1.150杠板歸乙醇提取物低劑量組 45.114±5.009 5.199±1.367 13.882±0.831

3.2 杠板歸乙醇提取物對AST、ALT 活性的影響 表2 顯示，與空白組比較，模型組AST、ALT活性顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，杠板歸乙醇提取物組兩者活性（除低劑量組AST 外） 顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

注：與空白組比較，??P ＜0.01；與模型組比較，▲P ＜0.05，▲▲P＜0.01

3.3 杠板歸乙醇提取物對各組織中SOD 活性、MDA 水平的影響 表3 ～4 顯示，與空白組比較，模型組各組織中SOD 活性顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），MDA 水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，杠板歸乙醇提取物高、中劑量組各組織中（除中劑量組心臟中外） 前者活性顯著升高（P＜0.05），高劑量組各組織中、中劑量組肝臟中后者水平顯著降低（P＜0.05）。

3.4 杠板歸乙醇提取物對小鼠組織病變的影響

3.4.1 肝臟HE 染色 圖1 顯示，空白組小鼠肝小葉結構完整清晰，肝細胞索排列整齊，肝細胞形態(tài)正常，無細胞壞死等病變；模型組小鼠肝小葉結構模糊，肝細胞索紊亂，伴有炎性細胞浸潤，細胞出現(xiàn)片狀壞死；聯(lián)苯雙酯滴丸組、杠板歸乙醇提取物組小鼠病變程度較輕，肝小葉結構基本完整，炎癥細胞浸潤改善，無片狀細胞壞死。

表3 杠板歸乙醇提取物對各組織中SOD 活性的影響（，n=12）Tab.3 Effects of ethanol extract of P．perfoliatum on SOD activity in various tissues（，n=12）

表3 杠板歸乙醇提取物對各組織中SOD 活性的影響（，n=12）Tab.3 Effects of ethanol extract of P．perfoliatum on SOD activity in various tissues（，n=12）

注：與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05

組別 肝臟／（U·mg prot-1） 心臟／（U·mg prot-1） 腎臟／（U·mg prot-1）空模聯(lián)杠杠白型苯板板組組雙歸歸 酯乙乙 滴醇醇丸提提組取取 物物 高中劑劑量量組組 21211 75087 56180.....39633 68546 40765±±±±±22712 55.84..6..30355 71126 5144▲ ?▲▲ ? 21211 15087 47507.....84463 83022 84195±±±±±23223 44512.....61374 53342 78159 ?▲▲? 21111 04788 33570.....64106 22615 25262±±±±±32213 18640.....56346 65805 24754?▲▲▲杠板歸乙醇提取物低劑量組 168.365±28.247 176.783±30.920 183.772±30.572

表4 杠板歸乙醇提取物對各組織中MDA 水平的影響（，n=12）Tab.4 Effects of ethanol extract of P．perfoliatum on MDA level in various tissues（，n=12）

表4 杠板歸乙醇提取物對各組織中MDA 水平的影響（，n=12）Tab.4 Effects of ethanol extract of P．perfoliatum on MDA level in various tissues（，n=12）

注：與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 肝臟／（nmol·mg prot-1） 心臟／（nmol·mg prot-1） 腎臟／（nmol·mg prot-1）空模聯(lián)杠杠白型苯板板組組雙歸歸 酯乙乙 滴醇醇丸提提組取取 物物 高中劑劑量量組組 11 84891.....47946 74752 48125±±±±±72415.....88663 56791 84662 ?▲▲▲ ▲ 14233 12801.....54161 07450 40323±±±±±41191.32.3 5..0.06481 52978 680▲?▲?▲ 11111 16334.....80293 70779 25024±±±±±34233.....85709 05602 13026?▲▲杠板歸乙醇提取物低劑量組 11.704±6.354 31.352±9.715 14.662±3.048

3.4.2 心臟HE 染色 圖2 顯示，空白組小鼠心肌細胞排列緊密，細胞核呈橢圓形，胞質呈均一狀；模型組小鼠部分心肌細胞呈輕度肥大狀，胞質局部淡染，間質內部分毛細血管充血和炎細胞浸潤；聯(lián)苯雙酯滴丸組、杠板歸乙醇提取物組小鼠心肌細胞肥大現(xiàn)象明顯減輕。

3.4.3 腎臟HE 染色 圖3 顯示，空白組小鼠腎小球內皮細胞、足細胞、系膜細胞未見異常；模型組小鼠腎小球內毛細血管腔高度擴張，內皮細胞核呈固縮狀，胞質空化，基底膜變薄，足細胞高度腫脹，胞質空化，足突細小或局部融合；聯(lián)苯雙酯滴丸組、杠板歸乙醇提取物組小鼠腎小球結構均有不同程度的改善。

4 討論

中醫(yī)認為，心主血，肝藏血，肝為心之母，母病及子，故肝病可累及心，臨床上肝病可及心，心病可及肝；肝藏血，腎藏精，精血同生，故肝陰和腎陰相互滋養(yǎng)，并且肝腎相生，均內藏相火，同時相火源于命門， 故肝和腎虛實密切相關， 相互制約。

圖1 杠板歸乙醇提取物對小鼠肝臟組織病理形態(tài)學的影響（×400）Fig.1 Effect of ethanol extract of P．perfoliatum on the pathomorphology of mouse liver tissues（×400）

圖2 杠板歸乙醇提取物對小鼠心臟組織病理形態(tài)學的影響（×400）Fig.2 Effect of ethanol extract of P．perfoliatum on the pathomorphology of mouse heart tissues（×400）

圖3 杠板歸乙醇提取物對小鼠腎臟組織病理形態(tài)學的影響（×400）Fig.3 Effect of ethanol extract of P．perfoliatum on the pathomorphology of mouse kidney tissues（×400）

化學性肝損傷是由化學肝毒物質所造成的肝損傷，而CCl4是公認的復制肝損傷動物模型的化學物質［5］，故本實驗以其誘導小鼠亞急性肝損傷。結果，模型組與空白組之間各指標存在明顯差異，可認為造模成功。

AST、ALT 均為非特異性細胞內功能酶，是臨床上常用肝功能評價指標，正常情況下兩者活性在血清中很低，而當肝細胞損傷時會發(fā)生變化，故其在一定范圍內可反映生物體內肝細胞損傷程度［9］。本實驗發(fā)現(xiàn)，杠板歸乙醇提取物可明顯降低AST、ALT 活性，表明它可改善肝細胞膜通透性和流動性，減少肝功能損傷。

SOD 能清除自由基以維持細胞不受自由基損害，其主要作用是降解清除體內的活性氧自由基，故檢測其活性可反映清除自由基的能力及抗氧化能力［10］；MDA 作為脂質過氧化終產(chǎn)物，是反映組織損傷時出現(xiàn)過強氧化作用的指標之一，其活性越高，表明氧化活性越強，組織受損程度越大［11］。本實驗發(fā)現(xiàn)，杠板歸乙醇提取物能明顯升高SOD、MDA 活性，表明它可有效維持組織抗氧化體系平衡狀態(tài)，減輕CCl4引發(fā)組織氧化損傷。

另外，組織病理學發(fā)現(xiàn)杠板歸乙醇提取物可明顯減輕小鼠肝臟、心臟、腎臟細胞病理損傷，表明它在保護肝臟受損的同時對兩者也有改善作用，但其關聯(lián)機制還需進一步深入研究。