孫 潔， 馬 旗， 王 璐， 胡雪劍， 楊 揚(yáng)， 李 赟， 楊 燕

（蘭州大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，甘肅 蘭州730030）

以高血糖為標(biāo)志的糖尿病是重要慢性病之一，迄今高血糖發(fā)生機(jī)制基本環(huán)節(jié)中胰島β 細(xì)胞衰竭仍是主要因素，而β 細(xì)胞凋亡在其功能衰竭的發(fā)生中起著決定性作用［1-2］。研究表明，β 細(xì)胞長(zhǎng)期暴露在高游離脂肪酸環(huán)境中可激活其線粒體氧化應(yīng)激途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞脂性凋亡，胰島素合成和分泌減少，從而導(dǎo)致β 細(xì)胞功能衰退［3-4］。

翻白草為薔薇科委陵菜屬植物翻白草Potentilla discolor Bge.的帶根全草，具有降糖、降脂等多種生物活性，但其具體作用機(jī)制尚不明確，目前鮮有關(guān)注它對(duì)胰島細(xì)胞功能的直接影響。黃酮、萜類作為翻白草的主要活性成分，具有抗氧化應(yīng)激作用［5］，由此假設(shè)翻白草可通過(guò)抗氧化作用減輕胰島細(xì)胞脂性凋亡，從而改善胰島素分泌功能。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的Wistar 大鼠原代胰島細(xì)胞，棕櫚酸處理以建立脂毒性損傷細(xì)胞凋亡模型，并用翻白草水提液作為干預(yù)因素，旨在探討該藥材對(duì)胰島細(xì)胞脂毒性損傷的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 2 月齡健康雄性清潔級(jí)Wistar 大鼠30只，購(gòu)自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（甘）2017-0003。

1.2 試劑 翻白草采于甘肅省定西市，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院專家鑒定為正品。AnnexinV-FITC試劑盒，購(gòu)自南京凱基公司；膠原酶P，購(gòu)自瑞士Roche 公司；大鼠胰島素ELISA 試劑盒，購(gòu)自美國(guó)R＆D 公司；Ficoll 400，購(gòu)自美國(guó)Pharmacia 公司；棕櫚酸、牛血清白蛋白（BSA），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BML-275（AMPK 選擇性抑制劑），購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；兔抗AMPK（Thr-172） 抗體、鼠抗胰島素抗體，購(gòu)自美國(guó)CST 公司；qPCR 試劑盒，購(gòu)自日本TaKaRa 公司； 還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA） 試劑盒，購(gòu)自南京建成生物研究所。

1.3 儀器 FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；全自動(dòng)激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司）；凝膠成像系統(tǒng)、實(shí)時(shí)定量PCR 系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 翻白草水提液制備［5］將全草烘干粉碎，加水煎煮3 次，加水量分別為生藥體積的10、10、8倍量，煎煮時(shí)間分別為1.5 h、1.5 h、40 min，過(guò)濾，合并濾液，蒸發(fā)濃縮，70 ℃真空干燥，粉碎，過(guò)80 目篩，l g 提取物相當(dāng)于生藥6 g。稱定提取物62.5 mg，溶于5 mL DMSO 中，配制成12.5 g／L的母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)吸取16 μL 母液加到2 mL 培養(yǎng)基中，配成10 mg／L 含藥培養(yǎng)基。

2.2 胰島分離和純化 大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，消毒后從下腹作V 型切口，膽總管插管，破心放血后，經(jīng)膽總管逆行注入膠原酶P 溶液，摘除完整胰腺，37 ℃水浴消化11 min，Hank’s液終止消化，沉淀物加4 mL25%Ficoll 混勻，再加入23%、 20%、 11% Ficoll 液 和Hank’ s 液 各2 mL，1 900 r／min 離心25 min，收集23%→20%、20%→11%界面上細(xì)胞層，純化的胰島懸液接種于RPMI 1640 培養(yǎng)液， 細(xì)胞鋪展貼壁后進(jìn)行分組培養(yǎng)。

2.3 胰島染色 將胰島制備物與雙硫腙混合后孵育10 min，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)雙硫腙細(xì)胞團(tuán)數(shù)（胰島細(xì)胞為猩紅色，非胰島細(xì)胞不著色）。

2.4 分組 ①對(duì)照組， 培養(yǎng)在0.5% BSA 中；②棕櫚酸組，劑量0.5 mmol／L；③翻白草水提液+棕櫚酸組，劑量分別為10 mg／L、0.5 mmol／L，共同孵育；④BML-275 組，含0.5 mmol／L 棕櫚酸+10 mg／L 翻 白 草 水 提 液+10 μmol／L BML-275，BML-275 預(yù)處理胰島細(xì)胞1 h 后再與翻白草水提液、棕櫚酸共同孵育。胰島細(xì)胞均孵育24 h。

2.5 FDA／PI 熒光雙染 雙醋酸熒光素（FDA）可侵入活細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，而活細(xì)胞對(duì)PI 染料拒染，PI 與死亡細(xì)胞的核酸結(jié)合，發(fā)出紅色熒光。吸盡6 孔板中舊培養(yǎng)基，取適量FDA／PI 熒光染液，與胰島制備物混合5 ～10 min，在共聚焦顯微鏡下檢測(cè)。

2.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 胰島以0.05%胰酶-EDTA消化分散成單細(xì)胞懸液后，接種于6 孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)穩(wěn)定后按“2.4” 項(xiàng)下不同干預(yù)措施孵育24 h。 收集細(xì)胞，多次離心、 洗滌后依次加入10 μL FITC 標(biāo)記的AnnexinV， 輕輕混勻， 避光15 min后再加入300 μL Binding Buffer 和5 μL 碘化丙啶（PI），避光反應(yīng)5 min 后上機(jī)檢測(cè)。

2.7 胰島素分泌功能檢測(cè) 計(jì)數(shù)大鼠胰島，換算為相當(dāng)于直徑150 μm 的胰島當(dāng)量 （IEQ）， 于15 cm培養(yǎng)皿中接種30 IEQ／皿。干預(yù)24 h 后，每組收集15 個(gè)胰島，PBS 洗滌，加入含3.0 mmol／L葡萄糖KRBH 培養(yǎng)液緩沖30 min 后，分別在含3.0 mmol／L（低糖）、20 mmol／L（高糖） 葡萄糖的KRBH 培養(yǎng)液中培養(yǎng)1 h，上清液與-20 ℃冰箱中保存，ELISA 檢測(cè)基礎(chǔ)胰島素分泌（BIS）、葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS），計(jì)算刺激指數(shù)（SI），公式為SI=BIS／GSIS。

2.8 免疫熒光檢測(cè) 胰島細(xì)胞接種于載玻片上，相應(yīng)干預(yù)后4%多聚甲醛固定， 封閉后， 兔抗AMPK（腺苷酸激活的蛋白激酶） 抗體和鼠抗胰島素抗體過(guò)夜孵育，DAPI 染色，封片，激光共聚焦下觀察。

2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR） 檢測(cè) Trizol 裂解后抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，qPCR 檢測(cè)目的基因mRNA 表達(dá)水平，以β-actin 為內(nèi)參，2-ΔΔCt計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。引物序列如表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.10 蛋白免疫印跡檢測(cè) 抽提總蛋白，測(cè)定蛋白量后常規(guī)SDS-PAGE 電泳轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，依次加入稀釋的相應(yīng)一抗、二抗反應(yīng)，并依次洗脫，ECL 顯影曝光，Quantity One 軟件進(jìn)行圖像灰度值分析，以條帶灰度值之比計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.11 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 收集各處理組胰島細(xì)胞，硫代巴比妥酸法檢測(cè)丙二醛（MDA） 活性，分光光度計(jì)法檢測(cè)還原型谷胱甘肽（GSH） 活性，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.12 統(tǒng)計(jì)分析 通過(guò)SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有顯著性意義。

3 結(jié)果

3.1 胰島分離及胰島β 細(xì)胞原代培養(yǎng) 純化的大鼠胰島細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中18 ～24 h，可見(jiàn)貼壁生長(zhǎng)。圖1 顯示，DTZ 染色后大鼠胰島呈現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)樣結(jié)構(gòu)，猩紅色，圓形或橢圓形，包膜不明顯，折光性較強(qiáng)，直徑50 ～300 μm 不等，而其他外分泌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞未見(jiàn)紅染。本實(shí)驗(yàn)分離大鼠胰島細(xì)胞純度為（89.23±2.9）%，每只可分離（823±24） 個(gè)胰島，細(xì)胞存活率在（93.1±3.1）%以上。

圖1 大鼠胰島DTZ 染色Fig.1 DTZ staining of rat islets

3.2 翻白草水提液對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡的抑制作用 FDA／PI 雙染后共聚焦顯微鏡（圖2）顯示，對(duì)照組很少見(jiàn)到死亡細(xì)胞；棕櫚酸組紅色熒光的死亡細(xì)胞，明顯多于對(duì)照組；翻白草水提液干預(yù)后死亡細(xì)胞明顯少于棕櫚酸組，細(xì)胞存活率明顯更高。AnnexinV／PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)（圖3） 顯示，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（11.35±0.80）%；棕櫚酸持續(xù)作用于胰島細(xì)胞24 h 后， 凋亡率顯著升高［ （36.35±1.55）%，P＜0.01］；翻白草水提物+棕櫚酸組細(xì)胞凋亡率顯著降低［ （20.47±0.84）%，P＜0.01］。

圖2 大鼠胰島細(xì)胞FDA／PI 雙染Fig.2 FDA／PI double staining of rat islet cells

圖3 翻白草水提液對(duì)大鼠胰島細(xì)胞脂毒性凋亡的影響Fig.3 Effect of aqueous extract of Potentillae discoloris Herba on lipotoxicitic apoptosis of rat islet cells

3.3 翻白草水提液對(duì)GSIS 的影響 低糖、高糖溶液中胰島素分泌量分別為（5.97±0.31）、（21.03±1.11） μIU／mL，SI 為3.52，表明正常情況下胰島β 細(xì)胞分泌功能良好。圖4 顯示，與對(duì)照組比較，棕櫚酸組胰島細(xì)胞GSIS 顯著減少 ［棕櫚酸組（11.62±0.58） μIU／mL，對(duì)照組（21.03±1.11）μIU／mL，P＜0.01］；與棕櫚酸組比較，翻白草水提物+棕櫚酸組GSIS 顯著增加［翻白草水提物+棕櫚 酸 組 （17.28±0.86） μIU／mL， 棕 櫚 酸 組（11.62±0.58） μIU／mL，P＜0.01］。

圖4 翻白草水提液對(duì)GSIS 的影響Fig.4 Effect of aqueous extract of Potentillae discoloris Herba on GSIS

3.4 翻白草水提液對(duì)FAS、CPT-1、AMPK 表達(dá)的影響 表2、圖5A 顯示，與對(duì)照組比較，棕櫚酸組FAS mRNA 表達(dá)顯著升高， CPT-1 mRNA、 p-AMPK 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與棕櫚酸組比較，翻白草水提物+棕櫚酸組中FAS mRNA 表達(dá)顯著下降，CPT-1 mRNA 表達(dá)、p-AMPK 表達(dá)顯著升高（P ＜0.05）。圖5B 顯示，棕櫚酸處理后p-AMPK 免疫熒光強(qiáng)度較對(duì)照組明顯減弱；與棕櫚酸組比較，翻白草水提物+棕櫚酸組其熒光染色明顯增強(qiáng)。

表2 翻白草水提液對(duì)FAS、CPT-1 mRNA 表達(dá)的影響（，n=30）Tab.2 Effects of aqueous extract of Potentillae discoloris Herba on FAS and CPT-1 mRNA expressions（±s，n=30）

表2 翻白草水提液對(duì)FAS、CPT-1 mRNA 表達(dá)的影響（，n=30）Tab.2 Effects of aqueous extract of Potentillae discoloris Herba on FAS and CPT-1 mRNA expressions（±s，n=30）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與棕櫚酸組比較，#P＜0.05

組別 FAS CPT-1對(duì) 棕照 櫚組 酸 組 12..05 01± ±00..00 05 ? 10..05 00± ±00..00 0 5?翻白草水提物+棕櫚酸組 1.72±0.35# 0.80±0.08#

3.5 翻白草水提液對(duì)GSH、MDA 水平的影響 表3 顯示，與對(duì)照組比較，棕櫚酸組GSH 水平顯著降低，MDA 水平顯著升高（P＜0.05）；與棕櫚酸組比較，翻白草水提物+棕櫚酸組前者水平顯著升高，后者水平顯著降低（P＜0.05）。

圖5 翻白草水提液對(duì)p-AMPK 蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of aqueous extract of Potentillae discoloris Herba on p-AMPK protein expression

表3 翻白草水提液對(duì)GSH、MDA 水平的影響（±s，n=30）Tab.3 Effects of aqueous extract of Potentillae discoloris Herba on GSH and MDA levels（±s，n=30）

表3 翻白草水提液對(duì)GSH、MDA 水平的影響（±s，n=30）Tab.3 Effects of aqueous extract of Potentillae discoloris Herba on GSH and MDA levels（±s，n=30）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與棕櫚酸組比較，#P＜0.05

GSH／MDA／組別 （μmol·L-1） （nmol·mg prot-1）對(duì)棕翻照櫚白組酸草 組水 提 物+棕櫚酸組211 057 819...508±±±111 001...630 393 ?# 021...723 507±±±000...121 322?#

3.6 BML-275 對(duì)FAS、 CPT-1、 AMPK 表 達(dá) 及GSH、MDA 水平的影響 BML-275 預(yù)處理胰島細(xì)胞1 h 后，再加入翻白草水提液和棕櫚酸共同孵育24 h，結(jié)果見(jiàn)表4、圖6。由此可知，與翻白草水提物+棕櫚酸組比較，BML-275 組CPT-1 mRNA表達(dá)、p-AMPK 蛋白表達(dá)、 GSH 水平顯著降低，F(xiàn)AS mRNA 表 達(dá)、 MDA 水 平 顯 著 升 高 （P ＜0.05）。

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與棕櫚酸組比較，#P＜0.05；與翻白草水提物+棕櫚酸組比較，＆P＜0.05

圖6 BML-275 對(duì)p-AMPK 蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of BML-275 on p-AMPK protein expression

4 討論

游離脂肪酸長(zhǎng)期升高可使胰島β 細(xì)胞凋亡、數(shù)量減少、功能衰竭，稱為“脂性凋亡”。本實(shí)驗(yàn)采用胰島原代細(xì)胞培養(yǎng)、FDA／PI 雙染、AnnexinV／PI 雙染流式定量方法，觀察棕櫚酸對(duì)胰島細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)該成分可誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞存活率，然后檢測(cè)大鼠胰島細(xì)胞BIS／GSIS 水平，發(fā)現(xiàn)它對(duì)胰島細(xì)胞BIS 水平無(wú)顯著影響，但能抑制GSIS 水平，表明它損傷了β 細(xì)胞分泌功能。GSIS 損害是2 型糖尿病早期特征之一，由于脂肪酸誘導(dǎo)β 細(xì)胞死亡、數(shù)量減少及其導(dǎo)致的胰島素分泌功能受損，至少有一部分歸因于脂毒性凋亡，故推測(cè)防止β 細(xì)胞脂性凋亡可能有益于預(yù)防或治療T2DM。

萜類、黃酮是翻白草主要化學(xué)成分，其中后者能有效地調(diào)節(jié)糖脂代謝［6-9］，但其具體降糖機(jī)制尚未闡明。韓永明等［10］報(bào)道，翻白草能有效保護(hù)胰島β 細(xì)胞；鄒志堅(jiān)等［11］通過(guò)大鼠腹腔注射四氧嘧啶建立糖尿病模型，分為高、中、低3 個(gè)劑量組，連續(xù)給予黃酮提取物14 d 后發(fā)現(xiàn)，胸腺指數(shù)、超氧化物歧化酶活性明顯上升，血清丙二醛水平明顯下降，表明該成分對(duì)糖尿病大鼠有治療作用，可能是通過(guò)提高抗氧化能力和增強(qiáng)免疫力來(lái)實(shí)現(xiàn)的；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，翻白草水提液處理后胰島細(xì)胞凋亡率較棕櫚酸明顯下降，而細(xì)胞存活率、GSIS 明顯升高，表明它可抑制胰島細(xì)胞脂性凋亡，改善β 細(xì)胞已受損的分泌功能。胰島細(xì)胞中抗氧化酶水平很低，易受氧化應(yīng)激損傷，而長(zhǎng)期暴露在高游離脂肪酸環(huán)境下可使線粒體活性氧簇生成增加，氧化應(yīng)激激活，線粒體功能發(fā)生障礙，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而損害β 細(xì)胞的合成與分泌功能，故氧化應(yīng)激毒性是導(dǎo)致胰島細(xì)胞脂性凋亡的直接原因［12］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸處理后胰島細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 水平明顯升高，非酶性抗氧化物GSH 水平明顯降低，提示游離脂肪酸的負(fù)載引起胰島細(xì)胞氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激；翻白草水提液干預(yù)后可降低胰島細(xì)胞MDA 水平，升高GSH 水平，表明它可緩解游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。

AMPK 是細(xì)胞內(nèi)的能量和代謝感受器，由α、β、γ 三個(gè)亞單位構(gòu)成的三聚體，前者α 亞基是AMPK 的主要催化亞基，當(dāng)其（Thr172 位點(diǎn)） 磷酸化后可激活A(yù)MPK，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)糖、脂肪酸和能量代謝［13］，而AMPK 對(duì)脂質(zhì)代謝的影響是通過(guò)抑制乙酰輔酶A 羧化酶、FAS 等脂肪酶的活性抑制脂肪合成，同時(shí)增加CPT-1 活性以促進(jìn)脂肪酸氧化［14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸可明顯抑制胰島細(xì)胞中p-AMPK 蛋白表達(dá)，增加其下游靶基因FAS mRNA 表達(dá)，減少CPT-1 mRNA 表達(dá)，表明它能抑制AMPK 通路激活；翻白草水提液處理后，能緩解棕櫚酸對(duì)AMPK 通路的抑制作用，上調(diào)p-AMPK 蛋白表達(dá)及其靶基因CPT-1 mRNA 表達(dá)，并下調(diào)了FAS mRNA 表達(dá)，但AMPK 特異性抑制劑BML-275 則衰減了這一作用，表明翻白草水提液減輕脂毒性的作用至少有一部分依賴于其對(duì)AMPK通路的調(diào)節(jié)。

研究表明，AMPK 激活后可抑制NADPH 氧化酶的胞質(zhì)內(nèi)亞基p47phox、p67phox表達(dá)，從而緩解高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激［15］，它可通過(guò)激活核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）介導(dǎo)的抗氧化信號(hào)通路，上調(diào)肝細(xì)胞抗氧化酶（如超氧化物岐化酶，過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶） 表達(dá)，從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)［16］；同時(shí)還能增加NADPH數(shù)量，減少NADPH 消耗，減輕成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)， 從而調(diào)節(jié)骨代謝平衡［17］。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BML-275 組胰島細(xì)胞中MDA 水平較翻白草水提物+棕櫚酸組明顯升高、GSH 水平明顯降低，表明AMPK 活性的抑制減緩了翻白草水提物對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的緩解作用。

綜上所述，在脂肪酸誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞脂性損傷模型中，翻白草水提液可能通過(guò)激活A(yù)MPK 通路，抑制脂肪酸合成，促進(jìn)脂肪酸β 氧化，減輕脂毒性，緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕細(xì)胞脂性凋亡，最終改善胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷，這將為該藥材及其有效成分治療2 型糖尿病提供新的理論依據(jù)。今后，將進(jìn)一步觀察和探索翻白草在體內(nèi)的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制，以期更有力地證實(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。