鄭 鵬， 趙 昭， 李佳佳， 頓佳穎， 李春花?

（1.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北 石家莊050200；2.河北省圖書館，河北 石家莊050011）

氣滯胃痛顆?；凇秱摗?中的四逆散，由枳殼、香附（炙）、元胡索（炙）、甘草（炙）、白芍、柴胡組成，已在全國數(shù)千家醫(yī)院推廣應(yīng)用20 余年［1］，有效率達(dá)85%以上。張春艷等［2］對氣滯胃痛顆粒揮發(fā)性成分進(jìn)行表征及藥材歸屬，發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性成分來源于枳殼與香附，前者主要為檸檬烯，具有減痛、抑菌、消炎、防治癌癥的作用［3］；α-香附酮、香附烯酮，具有抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、抑制子宮收縮等作用，在婦科疾病治療中有廣泛應(yīng)用［4］。本實(shí)驗(yàn)基于響應(yīng)面法結(jié)合信息熵法，優(yōu)化氣滯胃痛顆粒中揮發(fā)性成分提取工藝。

1 材料

1.1 儀器 SPH-300 氫氣發(fā)生器、SPB-3 全自動(dòng)空氣源 （北京HP 分析技術(shù)研究所）； 安捷倫7890B 氣相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；LQA10002 電子天平（上海樂祺精密電子廠）；BSM1 204 分析天平（上海卓精儀器廠）；KQ-300DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料 枳殼（批號16081801）、醋香附（批號16120301） 購自安國藥材市場，經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)研究院孫寶惠老師鑒定符合2015 年版《中國藥典》 一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。 檸檬烯、 α-香附酮（Z1708242）、香附烯酮（Z1705241） 對照品。無水乙醇、甲醇為分析純（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提?。?-6］按組方比例稱取枳殼、醋香附各50 g，粉碎后置于圓底燒瓶中，加適量水混勻，連接提取-共沸精餾耦合裝置提取一定時(shí)間，按2015 年版《中國藥典》 規(guī)定讀取揮發(fā)油量，并計(jì)算其含有量。

2.2 單因素試驗(yàn)［7］稱取樣品4 份，其中3 份按2015 年版《中國藥典》 規(guī)定分別制成粗粉、中粉、細(xì)粉，另1 份保持不變，固定浸泡時(shí)間3 h、提取時(shí)間3 h、加水量7 倍，按“2.1” 項(xiàng)下方法提取揮發(fā)油， 測得4 份樣品提取率分別為0.25%、0.5%、0.45%、0.3%，即粗粉最高，故選擇其作為粒徑。

然后，對提取時(shí)間、加水量、浸泡時(shí)間進(jìn)行考察。稱取5 份樣品，固定浸泡時(shí)間3 h、加水量7倍，提取2、4、6、8、10 h，測得揮發(fā)油提取率分別為0.45%、0.6%、0.7%、0.7%、0.7%，即提取6 h 時(shí)最高，故選擇5、6、7 h；固定浸泡時(shí)間3 h、提取時(shí)間3 h，加入7、9、11、13、15 倍量水， 測得揮發(fā)油提取率分別為0.5%、 0.6%、0.65%、0.8%、0.8%，即加水量13 倍時(shí)最高，故選擇12、13、14 倍；固定加水量7 倍、提取時(shí)間3 h，浸泡0、1、2、3、4 h，測得揮發(fā)油提取率分別為0.25%、0.35%、0.35%、0.35%、0.3%，即浸泡1 h 時(shí)最高，故選擇0.5、1、1.5 h。

2.3 GC 法測定檸檬烯、α-香附酮、香附烯酮含有量

2.3.1 色譜條件［8-9］安捷倫HP-5 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；氫火焰離子化檢測器（FID） 檢測；程序升溫，見表1；進(jìn)樣量5 μL；分流比70 ∶1；載氣N2；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測器溫度260 ℃；空氣體積流量390 mL／min；氫氣體積流量36 mL／min；尾吹氣體積流量15 mL／min；氮?dú)怏w積流量1 mL／min。色譜圖見圖1。

表1 升溫程序Tab.1 Heating-up programs

2.3.2 對照品溶液制備 分別精密稱取檸檬烯、α-香附酮、香附烯酮對照品7.90、6.70、1.92 mg，置于5 mL 量瓶中， 甲醇定容至刻度， 即得（1.58、1.34、0.384 mg／mL）。

2.3.3 供試品溶液制備 按“2.1” 項(xiàng)下方法提取揮發(fā)油，無水硫酸鈉干燥后3 000 r／min 離心6 min，取0.1 mL 置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解，即得。

圖1 各成分GC 色譜圖Fig.1 GC chromatograms of various constituents

2.3.4 線性關(guān)系考察 取對照品溶 液， 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定5 次，其中α-香附酮、 香附烯酮進(jìn)樣量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μL， 檸 檬 烯 分 別 為1.0、 2.0、 3.0、4.0、5.0 μL。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得檸檬烯、α-香附酮、香附烯酮峰面積RSD 分別為0.94%、0.52%、1.73%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下于2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣測定，測得檸檬烯、α-香附酮、香附烯酮峰面積RSD 分別為0.27%、0.16%、0.25%，表明溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得檸檬烯、α-香附酮、香附烯酮峰面積RSD分別為0.26%、0.12%、0.23%，表明趕快方法重復(fù)性較好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)［10-11］分別稱取一定量檸檬烯含有量已知的枳殼飲片及α-香附酮、香附烯酮含有量已知的醋香附飲片，按2015 年版《中國藥典》 規(guī)定制成粗粉， 精密稱取6 份， 每份0.25 g，加入適量對照品溶液，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，檸檬烯、α-香附酮、香附烯酮平均加樣回收率分別為97.15%、97.83%、98.96%，RSD 分別為1.35%、1.61%、0.43%。

2.4 工藝優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design Expert 10.0 軟件，選擇加水量（A）、浸泡時(shí)間（B）、提取時(shí)間（C） 作為影響因素，揮發(fā)油提取率及檸檬烯、香附酮、香附烯含有量的綜合評分（Y） 作為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)3 因素3 水平、15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)（12 個(gè)析因試驗(yàn)、3個(gè)中心試驗(yàn)）。因素水平見表3，結(jié)果見表4。

表3 因素水平Tab.3 Factors and levels

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.4 Design and results of tests

2.4.2 信息熵［12-13］1 個(gè)評價(jià)指標(biāo)系統(tǒng)中有m 個(gè)評價(jià)對象、n 個(gè)評價(jià)指標(biāo)，其形成的原始指標(biāo)數(shù)據(jù)矩陣為Y= （yij） mn。對表5 數(shù)據(jù)處理，建立原始評價(jià)指標(biāo)矩陣（Xij）mn 和概率矩陣（Pij）mn。

計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)信息熵，得到評價(jià)指標(biāo)Hi，公式為Hi=-1／lnη×∑n

j=1Pij×lnPij，得Hi=［0.999 2 0.994 3 0.994 9 0.994 3］。再計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)Wi， 公 式 為［0.041 1 0.331 2 0.298 5 0.329 2］，分別代表揮發(fā)油提取率及檸檬烯、α-香附酮、香附烯酮含有量。

2.4.3 方程擬合與分析［14］通過Design Expert 10.0 軟件對表4 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得方程為Y=0.91+0.029A+0.049B+0.037C-0.036AB+0.061AC+0.035BC-0.061A2-0.088B2-0.070C2，方差分析見表5。

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

由表可知，模型有顯著影響（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05） 不顯著，表明模型真實(shí)可靠；各因素影響程度依次為B＞C＞A；各一次項(xiàng)、各二次項(xiàng)、 交互項(xiàng)AC 有顯著影響 （P ＜0.05， P ＜=0.882 0，表明該模型可解釋88.20%響應(yīng)值的變化；r=0.916 7，表明響應(yīng)值的變化有91.67%來源于所選變量，響應(yīng)面圖［15-16］見圖2。通過Design Expert 10.0 軟件分析，得到最優(yōu)工藝為加水量13.418 倍， 浸泡時(shí)間1.149 h，提取時(shí)間6.518 h，考慮到實(shí)際操作情況，將其修正為加水量13 倍，浸泡時(shí)間1.1 h，提取時(shí)間6.5 h。

圖2 各因素響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用“2.4.3” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測得綜合評分分別為0.931 6、0.912 0、0.923 0，平均0.922 2，與模型預(yù)測值0.932 2 相當(dāng)（偏離率為1%），表明模型預(yù)測性良好，穩(wěn)定可靠。

3 討論

正交試驗(yàn)只能進(jìn)行線性數(shù)學(xué)模型擬合［17］，確定單一因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響，但往往與真實(shí)值有較大差異；響應(yīng)面法通過Design Expert 10.0 軟件，可更直觀地分析各交互因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果與真實(shí)值差異較小。

目前，關(guān)于揮發(fā)油最佳提取工藝的研究大多僅選擇其提取率作為評價(jià)指標(biāo)，但所含有效成分含有量也是其發(fā)揮藥效的重要因素。本實(shí)驗(yàn)先對揮發(fā)油提取率進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再綜合檸檬烯、α-香附酮、香附烯酮含有量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，以期提高其準(zhǔn)確性。由于檸檬烯含有量與香附烯酮、α-香附酮有明顯差異，易于提取前者的方法不一定適合后兩者，故再通過信息熵賦予各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，計(jì)算其綜合評分，可使優(yōu)化工藝更嚴(yán)謹(jǐn)，并能有效提高氣滯胃痛顆粒中揮發(fā)油含有量，為該制劑進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。