楊寧輝， 曹伶俐， 付國輝， 唐滋貴

（1.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 新鄭451191；2.黃河科技學(xué)院，河南 鄭州450005）

蛇床子為傘形科植物蛇床Cnidiu mmonnieri（L.）Cusson 的成熟果實(shí)，其性味辛、苦，溫，有小毒，主歸腎經(jīng)，外用燥濕殺蟲止癢，內(nèi)服溫腎壯陽，祛寒燥濕。蛇床子素是蛇床子主要活性成分，具有抗病原微生物、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗變態(tài)反應(yīng)活性，另外還具有抗心律失常、降低血壓、降血脂、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤作用［1-5］，但其水溶性很差，生物利用度不高［4］。

為了更好地發(fā)揮蛇床子的臨床療效，需要開發(fā)新型蛇床子素中藥制劑［5］。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體是采用納米技術(shù)制備的可負(fù)載中藥活性成分的一種新劑型，具有緩釋性和靶向性［6］，可提高固體脂質(zhì)納米粒載藥量和包封率，有助于延緩藥物泄露等，而且所用載體在體內(nèi)可生物降解，無毒副作用。本實(shí)驗(yàn)首次制備蛇床子素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，考察其基本理化性質(zhì)，并研究大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為，為進(jìn)一步開發(fā)高效低毒、生物利用度高的相關(guān)新制劑提供參考［7-8］，也為其他難溶性中藥活性成分制劑研發(fā)提供新策略。

1 材料

1.1儀器Essentia LC-16 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；JY92-Ⅱ型探頭超聲儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；85-2 型磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；FA1004N 型電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）；RE-5205 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海隆拓儀器有限公司）；DZF-6050 型真空干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；DW-45L80 型超低溫冰箱 （杭州碩聯(lián)儀器有限公司）； Nano ZS90 型納米粒度儀（英國Malvern 公司）；XH-B型漩渦混合器（無錫沃信儀器有限公司）；MD200-2 型氮?dú)獯祾邇x（杭州奧威儀器有限公司）；S-108型超純水儀（美國Millipore 公司）。

1.2 試藥 蛇床子素原料藥（批號(hào)SL20160814GC，陜西森郎生物化工有限責(zé)任公司）；蛇床子素對(duì)照品（CAS 號(hào)484-12-8，華夏標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，含有量＞98%）；丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)110708-201407，中國食品藥品檢定研究院，含有量99.2%）；單硬脂酸甘油酯（西隴化學(xué)試劑有限公司）；Miglyol?812（批號(hào)20161115S，上海特伯化學(xué)科技有限公司）；泊洛沙姆188（F68，批號(hào)P151125，艾美捷科技有限公司）；大豆卵磷脂（PC-98T，輔必成上海醫(yī)藥科技有限公司）；超濾離心管（截留相對(duì)分子量10 000，美國Millipore 公司）。

1.3 動(dòng)物 SD 大鼠，雌雄兼有，體質(zhì)量約300 g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（豫）2016-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備 稱取單硬脂酸甘油酯320 mg、Miglyol?812 80 mg，置于圓底燒瓶中水浴加熱熔融，繼續(xù)加入25 mg 蛇床子素混勻，作為油相；稱取F68 0.33 g、大豆卵磷脂0.66 g，加入100 mL 蒸餾水，超聲溶解后取20 mL，水浴加熱至相同溫度，作為水相。在1 200 r／min 攪拌速度下用注射器將水相緩慢加到油相中，繼續(xù)攪拌1 h，得到初乳，超聲10 min（600 W，間隔3 s）后置于-8 ℃冰箱中15 min 進(jìn)行固化，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得，其混懸液中蛇床子素含有量為1.64 mg／mL。再同法制備空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。

2.2 蛇床子素含有量測(cè)定［7-8］

2.2.1 色譜條件 Waters-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-水（55 ∶45）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)321 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液1.0 mL，置于10 mL 量瓶中，加入8 mL乙腈超聲15 min，靜置30 min 后流動(dòng)相定容，搖勻，12 000 r／min 離心10 min，精密量取上清液1.0 mL 置于10 mL 量瓶中，流動(dòng)相定容，搖勻，即得。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取蛇床子素對(duì)照品10.0 mg，避光下置于10 mL 量瓶中，乙腈超聲溶解后定容， 得到1.0 mg／mL 貯備液， 精密量取0.4 mL，乙腈定容至10 mL，得到40.0 μg／mL 對(duì)照品溶液， 同法稀釋成20.0、10.0、1.0、0.4、0.04 μg／mL，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（Y） 對(duì)溶液質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，得方程為Y=1.302 6X-0.010 1（r=0.999 9），在0.04～40.0 μg／mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 方法學(xué)考察 取低、 中、 高質(zhì)量濃度（0.04、20.0、40.0 μg／mL） 對(duì)照品溶液，同1 d內(nèi)在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得峰面積RSD 分別為0.87%、0.29%、0.11%，表明該方法日內(nèi)精密度良好。取供試品溶液，于0、1、2、4、5 d 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得峰面積RSD 為0.68%，表明溶液在5 d 內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密吸取1.0 mg／mL 對(duì)照品溶液75、150、225 μL，補(bǔ)加空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體75、150、225 μL，平行3 份，置于10 mL 量瓶中，加入8 mL 乙腈超聲15 min，靜置30 min 后流動(dòng)相定容，搖勻，12 000 r／min 離心10 min，測(cè)得平均加樣回收率為99.08%，RSD 小于1.79%。

2.3 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體基本性質(zhì)考察

2.3.1 包封率、載藥量 采用超濾離心法。精密量取1.0 mL 混懸液，置于超濾離心管內(nèi)管中，高速離心30 min（12 000 r／min），取外管超濾液，乙腈定容至1.0 mL，HPLC 法測(cè)定游離蛇床子素含有量（W游離）；再精密量取1.0 mL 混懸液， 加入2.0 mL乙腈超聲5 min，室溫下放置30 min 流動(dòng)相定容 至5.0 mL， 0.45 μm 微 孔 濾 膜 過 濾， 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定蛇床子素總含有量（W總），計(jì)算公式分別為包封率= ［（W總-W游離） ／W總］ ×100%、載藥量= ［（W總-W游離）／（W脂質(zhì)總量+W總-W游離）］ ×100% （W脂質(zhì)總量為固態(tài)、液態(tài)脂質(zhì)總含有量）。結(jié)果，3 批納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的平均包封率為88.17%，載藥量為5.06%。

2.3.2 粒徑、Zeta 電位 取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體1.0 mL，加入2.0 mL 蒸餾水稀釋，測(cè)定其粒徑、Zeta 電位，結(jié)果見圖1 ～2。由圖可知，粒徑介于100 ～500 nm 之間， 平均為226.25 nm， PDI 為0.204，Zeta 電位為-15.17 mV。

圖1 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑分布Fig.1 Size distribution of nanostructured lipid carriers

圖2 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的Zeta 電位Fig.2 Zeta potential of nanostructured lipid carriers

2.3.3 體外釋藥行為 取1.0 mg／mL 蛇床子素、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體 （以蛇床子素計(jì)含有量為2.0 mg） 混懸液，分別加入蒸餾水配制成2 mL，置于透析袋中（相對(duì)分子質(zhì)量8 000 ～14 000），放入500 mL 0.5%SDS 溶液中，于37 ℃、100 r／min恒溫振蕩器中實(shí)驗(yàn)，在不同時(shí)間點(diǎn)各取樣2 mL，保持溶出介質(zhì)體積不變，測(cè)定蛇床子素含有量，計(jì)算累積釋放率，繪制釋放曲線，結(jié)果見圖3。由圖可知，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體具有明顯緩釋特征，24 h內(nèi)累積釋放度為77.12%，遠(yuǎn)高于蛇床子素。

2.4 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為

2.4.1 對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)溶液制備 取“2.2.3” 項(xiàng)下貯 備 液， 稀 釋 成10.0、 25.0、 50.0、 100.0、200.0、400.0 ng／mL 對(duì)照品溶液。精密稱取丹皮酚10.0 mg， 加 入 約9.0 mL 乙 腈 超 聲， 靜 置30 min后定容，即得10.0 μg／mL 內(nèi)標(biāo)溶液，精密量取1.0 mL 于10.0 mL 量瓶中， 乙腈稀釋至1.0 μg／mL，置于冰箱中保存。

圖3 樣品體外釋放曲線Fig.3 In vitro release curves for samples

2.4.2 血漿樣品處理［8］將血漿樣品于室溫下避光放置一段時(shí)間解凍，精密吸取200 μL 于5 mL 離心管中，依次加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL、乙腈3.5 mL，渦旋混勻，沉淀蛋白，6 000 r／min、-5 ℃下高速離心8 min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相至離心管中，調(diào)整氮?dú)怏w積流量，45 ℃氮?dú)饩徛等ビ袡C(jī)溶劑，殘留物用200 μL 流動(dòng)相復(fù)溶，4 500 r／min 下離心5 min后進(jìn)樣20 μL 測(cè)定。

2.4.3 線性關(guān)系考察 取“2.4.1” 項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液各200 μL，45 ℃氮?dú)饩徛蹈?，依次加入空白大鼠血漿200 μL、內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，按“2.4.2” 項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以蛇床子素、內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為橫坐標(biāo)（X），溶液質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y=193.57X+2.86（R2=0.990 8），在10.0～400.0 ng／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4 方 法 學(xué) 考 察 取 低、 中、 高 （10.0、200.0、400.0 ng／mL） 質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，按“2.4.2” 項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得平均加樣回收率分別為92.18%、 93.66%、 90.99%， RSD 小 于6.83%。取3 種質(zhì)量濃度血漿樣品，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，每天1 次，連續(xù)5 d，測(cè)得日間精密度RSD 分別為9.15%、6.83%、7.44%；同一份樣品于同1 d 內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5 次，測(cè)得得日內(nèi)精密度RSD 分別為5.08%、3.71%、4.63%，表明該方法精密度良好。血漿樣品室溫下于0、4、8、12、24、48 h 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得峰面積RSD 為7.28%，表明樣品在室溫下48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 灌胃液制備 取蛇床子素混懸液（5.0 mg／mL），蒸餾水配制成3 mL，每只大鼠灌胃給藥15 mg／kg；取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸液，加入5%海藻糖作為凍干保護(hù)劑，置于-70 ℃超低溫冰箱中24 h，將預(yù)凍樣品迅速置于真空凍干機(jī)中36 h，即得凍干粉末， 其中蛇床子素含有量為3.08%。取凍干粉末0.487 g，加入3 mL 蒸餾水振蕩，即得，灌胃劑量同原料藥。

2.4.6 行為考察 12 只大鼠隨機(jī)分為蛇床子素組和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體組，先于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中空腹適應(yīng)24 h，再于預(yù)定時(shí)間點(diǎn)眼眶取血各約0.3 mL，玻璃毛細(xì)管引流至涂有肝素的離心管中，高速離心5 min（2 500 r／min），血漿按“2.4.2” 項(xiàng)下方法處理后在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算血藥濃度，Tmax、Cmax取實(shí)測(cè)值，梯形法計(jì)算時(shí)間-曲線下面積（AUC），結(jié)果見圖4、表1。由表可知，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體組Cmax、AUC0～t顯著高于蛇床子素組（P＜0.05，P＜0.01），而且Tmax顯著延后（P＜0.05），T1／2顯著延長(zhǎng)（P＜0.01），相對(duì)生物利用度提高了3.31 倍。

圖4 樣品血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.4 Plasma concentration-time curves for samples

表1 主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters（x ±s，n=6）

表1 主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters（x ±s，n=6）

注：與蛇床子素組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

參數(shù) 單位 蛇床子素組 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體組Tmax h 1.12±0.25 2.64±0.51?TCAA 1mUU／a2CC x 00～～∞t nn ngg··g·mm m hLL L--11-·· 1 hh 145 151 2311....6825 7653±±±±0167.962 8...4746 532 11 246 591 5336....9315 2625±±±±1322.103 2.37 74..753??79??????

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用固態(tài)脂質(zhì)單硬脂酸甘油酯和液態(tài)脂質(zhì)作為載體，制備了蛇床子素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，包封率達(dá)88.17%，而陳嬌婷等［9］對(duì)蛇床子素固體脂質(zhì)納米粒制備工藝進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其包封率僅為59.78%，這一方面可能是蛇床子素在液態(tài)脂質(zhì)Miglyol?812 中的溶解度較高，有助于促進(jìn)藥物包裹進(jìn)入納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中；另一方面液態(tài)脂質(zhì)的加入增加了納米載體的晶體混亂程度，有利于提高包封率及載藥量［10-15］。

藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示，蛇床子素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的吸收速率與蛇床子素原料藥明顯不同，其原因可能是蛇床子素混懸液進(jìn)入胃腸道后被迅速吸收進(jìn)入體循環(huán)，達(dá)峰時(shí)間較快；納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑較小，口服進(jìn)入胃腸道后被吸附在胃腸道壁上，甚至進(jìn)入絨毛間隙，增加在胃腸道黏膜上的滯留時(shí)間［10］而導(dǎo)致Tmax延后。文獻(xiàn)［11-14］ 報(bào)道，納米制劑可經(jīng)消化道上皮細(xì)胞直接進(jìn)入血液循環(huán)，也可經(jīng)上皮細(xì)胞或派伊爾結(jié)進(jìn)入淋巴循環(huán)，并以淋巴循環(huán)為主［10］，其生物利用度的提高可能與納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體改變了蛇床子素吸收途徑有關(guān)，可有助于避免肝臟首過效應(yīng)［16］，提高藥物吸收程度。綜上所述，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體可促進(jìn)蛇床子素順利吸收，有助于其藥理活性充分發(fā)揮［17-18］，也為進(jìn)一步研發(fā)相關(guān)制劑提供參依據(jù)。