畢樹立，成小華，劉昊，劉斌

帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一種常見的中老年人神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,主要病變位置在黑質(zhì)和紋狀體,其錐體外系主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩、姿勢步態(tài)異常，常伴有便秘等結(jié)腸功能障礙[1-2]。PD發(fā)生結(jié)腸功能障礙的具體機制尚不清楚,有文獻報道可能與腸道自噬功能紊亂有關(guān)[3]，對于人類而言，自噬引發(fā)的腸道疾病和功能失調(diào)可能更加危險，因此，自噬參與PD腸道功能失調(diào)的研究逐漸引起臨床工作者的重視。細胞自噬的形成與多種自噬因子有關(guān)，其中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP1-LC3, 簡稱LC3)為重要的細胞自噬因子[4]。丙炔苯丙胺(司來吉蘭)是一種常見的單胺氧化酶B拮抗劑，它能夠拮抗各種神經(jīng)毒素對黑質(zhì)細胞的毒害而起到神經(jīng)保護作用[5]，進而阻止PD進展，同時對胃功能障礙具有很好的保護作用[6]，但其對PD大鼠模型的結(jié)腸功能障礙影響如何尚不明確，本研究通過觀察司來吉蘭對PD模型大鼠結(jié)腸自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3表達的影響，探討司來吉蘭治療結(jié)腸功能障礙的可能機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只,4～5個月，體質(zhì)量250～300 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司；均飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動物實驗室，室溫控制在21～25℃左右，自然光照，先適應(yīng)喂養(yǎng)2周，再進行試驗。(2)藥物與試劑：司來吉蘭(Orion Corporation Espoo，F(xiàn)inland)，片劑，規(guī)格5 mg/片；魚藤酮粉末，購自北京博奧森生物工程有限公司；葵花油，購自唐山華盛超市；Anti-LC3與Rabbit Anti-Beclin 1購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色液購自北京中杉生物有限公司；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白購自華美生物公司；(3)儀器：奧林巴斯BX63全自動顯微鏡掃描系統(tǒng)購自日本奧林巴斯公司；高速臺式離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法 2013年1月—2017年10月唐山市開平醫(yī)院與華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院合作實驗。大鼠72只按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組與干預(yù)組，并根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，各組大鼠再隨機于模型制備成功后4 d和8 d分別取12只進行檢測，其中6只以免疫組織化學(xué)法檢測，6只以Western blot法檢測。

1.2.1 PD大鼠模型制備[7]： 因魚藤酮是脂溶性藥物，故應(yīng)用葵花油將魚藤酮充分溶解，配制成濃度為2 mg/ml魚藤酮葵花油溶液，然后充分震蕩、混勻，避光保存。模型組與干預(yù)組大鼠稱質(zhì)量后，以魚藤酮2 mg/kg給藥。經(jīng)碘伏消毒后，捏起大鼠的頸背部皮膚，在皮下注射脂溶性藥物。參照呂超男等[5]的帕金森病大鼠模型行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，進行行為學(xué)的檢測，大鼠的行為變化被分為6個等級記分：1分，大鼠表現(xiàn)為拒捕的行為減弱，豎毛、毛色變黃、變臟，弓背、主動活動減少；2分，除了有1分表現(xiàn)外，大鼠的自主活動明顯減少、動作遲緩，同時具有震顫或步態(tài)不穩(wěn)；4分，具有2分的表現(xiàn)且步態(tài)不穩(wěn)，或不能直線行走，或步行時間向一側(cè)旋轉(zhuǎn)；6分，可向單向斜臥，單側(cè)前肢和/或后肢的癱瘓，行走困難或進食困難；8分，單側(cè)前肢和/或后肢的完全癱瘓，四肢攣縮，體質(zhì)量明顯減輕，均不能進食；10分，瀕臨死亡或死亡。在行為學(xué)上，2～6分之間的大鼠神經(jīng)細胞缺失相對顯著，并且帕金森病動物模型可靠，可作為判定PD模型成功的標(biāo)志[8]。

1.2.2 干預(yù)方法： 當(dāng)模型制備成功后，每日給假手術(shù)組與模型組大鼠灌胃同等量生理鹽水，干預(yù)組每日灌胃丙炔苯丙胺0.5 mg/kg，每個亞組大鼠分別連續(xù)灌藥4 d或8 d。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 Beclin1、LC3陽性細胞表達檢測：采用免疫組化法檢測,按照試劑說明書操作步驟進行。每組隨機取6只大鼠，10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉后，行多聚甲醛灌流(濃度4%)后固定，大鼠剖腹后，取結(jié)腸1.5～2.0 cm，清除凈腸內(nèi)容物，剪掉腸管多余物質(zhì)，予4%多聚甲醛溶液分別固定24 h。常規(guī)方法包埋、切片、脫蠟、水化和抗原修復(fù)；將內(nèi)源性過氧化物酶用0.3%過氧化氫封閉20 min；1%山羊血清再次封閉 20 min，分別加入一抗(Anti-LC3、Rabbit Anti-Beclin 1)，4℃孵育18 h；加生物素二抗，37℃環(huán)境中孵育 25 min；再加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，37℃環(huán)境中孵育 25 min。以上各步驟分別用PBS 緩沖液浸洗 3 min×3 次。最后行 DAB 顯色,光鏡下仔細觀察。以胞質(zhì)或胞核呈淡黃色或棕褐色為陽性細胞，在100倍光鏡下，隨機觀察每組大鼠結(jié)腸互不重疊的6個視野，進行LC3、Beclin 1陽性細胞計數(shù)。

1.3.2 Beclin1、LC3蛋白表達檢測： 采用Western blot蛋白印記法檢測，取潔凈結(jié)腸1.5～2.0 cm，立刻投入液氮，在-80℃EP管中保存。將上述冷凍結(jié)腸取出，以濃度為40 mg/kg放入蛋白裂解液，電動勻漿，在冰浴環(huán)境中靜置30 min，離心取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩DS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育，以ECL顯色，膠片曝光顯影，結(jié)果用Image J圖像程序分析軟件分析目的蛋白條帶及內(nèi)參的吸光度值,二者的比值即為相對表達量。

1.3.3 1 h糞便排出量及含水量測定： 參考學(xué)者前期研究報道的實驗方法[9]，在造模成功后4 d與8 d，各組各取6只大鼠，將每只大鼠單獨放于底部鋪有濾紙的籠子內(nèi)，當(dāng)大鼠排出糞便后，立即收集于1個密閉管中,稱質(zhì)量后即為糞便排出量(濕質(zhì)量); 在65℃脫水爐中保存12 h，分別稱質(zhì)量即為糞便干質(zhì)量。糞便含水率(%)=(糞便濕質(zhì)量-糞便干質(zhì)量) /糞便濕質(zhì)量×100%。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠免疫組化檢測Beclin1、LC3陽性細胞比較 假手術(shù)組大鼠各時間點結(jié)腸可見少量Beclin1、LC3陽性細胞的表達。與假手術(shù)組比較，模型組各時間點結(jié)腸Beclin1、LC3陽性細胞數(shù)均顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，干預(yù)組大鼠各時間點結(jié)腸Beclin1、LC3陽性細胞數(shù)均顯著減少(P<0.01)；與4 d時比較，干預(yù)組8 d時Beclin1、LC3陽性細胞數(shù)顯著減少(P<0.01)，而假手術(shù)組及模型組不同時點比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 3組大鼠Western blot檢測Beclin1、LC3蛋白比較 蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組各時間點結(jié)腸可見Beclin1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達量較多(P均<0.01)。與模型組比較，干預(yù)組各時間點結(jié)腸Beclin1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達均減少(P<0.01)。與4 d時比較，干預(yù)組8 d時大鼠結(jié)腸Beclin1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達量降低(P<0.01),而假手術(shù)組及模型組不同時點比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)見表2，圖2、3 。

2.3 3組大鼠1 h糞便排出量及含水率比較 注射魚藤酮35 d左右，大鼠發(fā)生了PD行為學(xué)改變，其中5只大鼠不能進食水，給予淘汰，另有3只大鼠死亡，均給予補充。1 h糞便排出量及含水率模型組大鼠均低于假手術(shù)組(P<0.01)，干預(yù)組均高于模型組(P<0.01)；且干預(yù)組8 d時高于干預(yù)4 d時(P<0.01)，而假手術(shù)組及模型組各時點比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表1 3組大鼠結(jié)腸Beclin1、LC3陽性細胞數(shù)比較個/HP)

表2 3組大鼠結(jié)腸Beclin1和LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白比較

注：Beclin1相對分子質(zhì)量為50 000

圖23組大鼠結(jié)腸Beclin1蛋白比較

注：LC3Ⅱ、LC3Ⅰ相對分子質(zhì)量為16 000、18 000

3 討 論

目前PD的腸功能紊亂日益受到臨床關(guān)注，同時便秘是PD患者腸功能紊亂的最常見主訴[10-11]。有研究結(jié)果表明經(jīng)魚藤酮葵花油乳液制作的大鼠模型發(fā)生了便秘[12]，另一項研究結(jié)果證實PD大鼠模型早期發(fā)生了便秘[13]，本研究結(jié)果中PD模型組大鼠4 d、8 d時的1 h糞便排出量及含水量明顯低于假手術(shù)組，證明模型組大鼠的腸管蠕動速度明顯減慢，PD可能導(dǎo)致腸管功能障礙，這與Fasano等[14]的研究結(jié)果一致。

帕金森病患者早期發(fā)生便秘的機制尚不明確,可能是多因素交互作用的結(jié)果,如結(jié)腸多巴胺脫羧酶關(guān)鍵限速酶酪氨酸羥化酶(TH)的減少及α-突觸核蛋白(α-Syn)的增多[12]，另一項研究提示單光子發(fā)射計算機掃描的多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白(DAT)與便秘?zé)o關(guān)[2]，提示帕金森病患者便秘可能是非多巴胺通路的損害，如氧化應(yīng)激、細胞凋亡、興奮性毒性或自噬[3]，自噬可以理解為自食，其結(jié)局可導(dǎo)致細胞內(nèi)一部分受損或多余的老化蛋白和細胞器被吞噬和降解甚至消化，便于細胞生存，同時使機體應(yīng)對各種應(yīng)激狀態(tài)，但當(dāng)刺激過度或時間較長時，細胞會發(fā)生自噬性細胞凋亡，這種表現(xiàn)即可出現(xiàn)于帕金森大鼠模型黑質(zhì)紋狀體內(nèi)，又可在饑餓大鼠模型心肌中表現(xiàn)[15]。Beclin-1既是調(diào)控自噬的關(guān)鍵因子[16]，也是檢測自噬活性的重要標(biāo)志物。Beclin-1主要與Vps34蛋白結(jié)合形成Ⅲ型磷脂酰肌醇-3磷酸激酶復(fù)合體參與自噬泡的形成[17]。LC3是哺乳動物發(fā)生自噬的關(guān)鍵蛋白，其表達形式為LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，LC3Ⅰ經(jīng)過泛素化加工修飾，可與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3Ⅱ并融合于自噬體膜上，參與自噬體的形成，另有研究發(fā)現(xiàn)自噬體數(shù)量的多少與LC3Ⅱ含量的高低呈正相關(guān)，同時Western blot法檢測LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也是檢測自噬活性最直接的方法。眭怡群等[18]發(fā)現(xiàn)在大腸癌組織中Beclin-1、LC3的自噬活性明顯上調(diào)，提示自噬活性的提高在大腸癌發(fā)病過程中可能起著一定作用，吳淑華等[19]發(fā)現(xiàn)在大腸癌組織中Beclin-1、LC3蛋白表達量均明顯高于癌旁組織，提示過度自噬參與了結(jié)腸癌的發(fā)病進程。Tusco等[3]發(fā)現(xiàn)PD患者發(fā)生便秘與腸道發(fā)生自噬功能紊亂有關(guān)。關(guān)永俊等[20]發(fā)現(xiàn)大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細胞自噬蛋白Beclin-1、LC3表達明顯上調(diào)，表明Cajal間質(zhì)細胞發(fā)生了過度自噬性凋亡，這可能是大鼠慢傳輸型便秘的發(fā)病機制。本研究發(fā)現(xiàn)，PD大鼠模型組Beclin-1、LC3陽性細胞表達數(shù)量明顯增加，Beclin-1蛋白量、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ比值顯著升高。結(jié)果表明，大鼠經(jīng)魚藤酮給藥后,結(jié)腸細胞發(fā)生了自噬,在自噬早期,大鼠機體尚能夠有效清除結(jié)腸神經(jīng)變性產(chǎn)生的毒性物質(zhì),并可能對結(jié)腸蠕動有加強作用,但隨著疾病的進展,尤其是大鼠達到了帕金森大鼠模型的評分標(biāo)準(zhǔn)后,大鼠機體不能夠有效清除大量自噬細胞Beclin-1、LC3產(chǎn)生的毒性物質(zhì),導(dǎo)致PD大鼠模型結(jié)腸功能紊亂，進而發(fā)生了腸功能障礙,最終發(fā)生了便秘，進而提示PD模型大鼠結(jié)腸過度自噬可能參與了PD大鼠便秘的發(fā)生、發(fā)展過程。

表3 3組大鼠1 h糞便排出量及含水率的比較

丙炔苯丙胺對多巴胺的分解具有專一抑制性，能夠有效穩(wěn)定腦內(nèi)的多巴胺水平[21]，同時也能夠抑制突觸前膜對多巴胺的重新攝取，促進多巴胺的有效釋放，并能夠延緩左旋多巴的應(yīng)用時間，進而延緩PD患者臨床癥狀的發(fā)生。本研究顯示，PD模型大鼠經(jīng)司來吉蘭治療后，大鼠1 h糞便排出量及含水率顯著增加，同時，丙炔苯丙胺干預(yù)各亞組Beclin-1、LC3陽性細胞的表達及蛋白的含量均明顯減少，說明丙炔苯丙胺可能對結(jié)腸過度自噬性細胞Beclin-1、LC3產(chǎn)生的過多的蛋白質(zhì)或衰老的細胞器具有有效清除作用，并有時間積累效應(yīng)，使大鼠結(jié)腸細胞自噬基礎(chǔ)水平趨于穩(wěn)態(tài)，隨著大鼠結(jié)腸蠕動速度增快，PD大鼠的腸功能障礙得到改善，其作用機制可能與其抑制PD模型大鼠結(jié)腸自噬性細胞Beclin-1、LC3的過度自噬有關(guān)，且隨著治療時間的延長，效果更明顯。這可能為PD患者便秘的防治提供了一定的理論依據(jù)。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

畢樹立:設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；成小華：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；劉昊、劉斌：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)