姜洪勝，孫建華，吳泉峰，黃國全

結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，占全球癌癥發(fā)病率的近10%，且病死率高[1-2]。雖然結腸癌的治療手段取得一定的進展，但是由于難以早期診斷而錯過最佳治療時間，結腸癌患者生存率仍然很低。因此，迫切需要尋求新的可靠的生物標志物用于評估結腸癌的預后。GA結合蛋白亞單位a(GA binding protein transcription factor alpha subunit，GABPA)是GA結合蛋白a鏈，是由GABPA基因編碼的三個亞單位之一，其作為一個轉(zhuǎn)錄激活因子，發(fā)揮著DNA結合的功能，并且它還參與了細胞色素氧化酶的活化和線粒體功能的細胞核調(diào)控機制[3-4]。本研究通過檢測結腸癌患者與相應的癌旁組織的GABPA表達情況，分析其與患者臨床病理特征及預后的關系，探討GABPA在結腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集2007年1月—2011年12月湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院手術切除的結腸癌患者174例癌組織及對應癌旁組織標本，每例均有完整的臨床背景資料和病理組織學切片診斷支持，所有病例均經(jīng)至少2位病理學專家確診為結腸癌。所有標本均為手術切除后獲取的石蠟標本，所有病例在術前均未接受過放療、化療、免疫治療和分子靶向治療。

1.2 GABPA檢測方法 按照北京中杉金橋公司試劑盒的說明書進行SP二步法免疫組化染色，具體步驟如下: 石蠟切片放入60℃ 烤箱內(nèi)烘烤1 h;切片常規(guī)二甲苯溶液脫蠟、酒精梯度脫水; 95℃以上用EDTA抗原修復25 min，自然冷卻至室溫; 3% H2O2室溫靜置10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶;磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次，每次5 min;甩干PBS，滴加GABPA兔抗人單克隆抗體(購自Abcam公司)，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜; PBS 清洗3次，每次3 min;滴加試劑1，室溫孵育20 min，PBS清洗3次，每次2 min;滴加試劑2，室溫孵育20 min，PBS清洗3次，每次2 min;滴加DAB顯色液(購自武漢博士德生物工程有限公司)，鏡下掌握顯色程度;自來水充分沖洗;蘇木素復染1 min，脫水、透明、中性樹膠封片。

1.3 結果判定 每張石蠟切片在10×40倍光學顯微鏡下隨機取5個視野，GABPA蛋白陽性表達為棕黃或棕褐色染色，定位于胞漿。按以下標準評分: 0分，不著色或僅有弱著色；1分，淺棕色；2分，深棕色。計算每個視野下的陽性細胞數(shù)，著色細胞占細胞總數(shù)<5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。應用染色強度評分值與陽性細胞百分數(shù)評分值相加，對GABPA蛋白的表達分為：低表達0～4分，高表達5～6分。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用頻數(shù)或率(%)表示，采用卡方檢驗分析GABPA表達水平高低與臨床病理特征的相關性；采用Kaplan-Meier分析評估GABPA蛋白表達對結腸癌患者生存率的影響；采用Cox回歸(比例風險模型)對預后因素進行多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 GABPA蛋白在結腸癌組織及癌旁組織的表達 運用免疫組化檢測174例結腸癌組織和對應的癌旁正常組織中GABPA蛋白的表達情況。GABPA陽性染色為棕黃色或深褐色，其主要表達定位于細胞漿中(圖1見封3)。免疫組化檢測結果顯示，癌組織GABPA的陽性表達為20.11%(35/174)，顯著低于癌旁組織55.17%(96/174)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.23,P<0.05)。

2.2 GABPA蛋白表達與結腸癌患者臨床病理特征的關系 為研究GABPA的表達水平與結腸癌患者臨床病理特征之間是否相關，將結腸癌組織中GABPA表達量取平均值分為低表達組84例和高表達組90例。GABPA蛋白在結腸癌中的低表達與淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(P<0.05),而GABPA蛋白高表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、血管侵潤和分化程度無顯著相關性(P>0.05)，見表1。

2.3 GABPA表達水平與臨床預后之間的關系 隨訪8年，分析了結腸癌患者的臨床信息。174例結腸癌患者中死亡92例(GABPA低表達組56例，GABPA高表達組36例)。利用Kaplan-Meier分析結腸癌患者中GABPA表達水平與臨床預后之間的關聯(lián)。檢查結果發(fā)現(xiàn)，與GABPA高表達的患者相比，GABPA低表達的患者總生存的平均天數(shù)更短(χ2=7.15,P= 0.006)，見圖2。

圖2 Kaplan-Meier分析結腸癌患者GABPA表達水平與臨床預后之間的關聯(lián)

2.4 采用Cox回歸(比例風險模型)對預后因素進行分析 單變量Cox比例風險回歸模型分析顯示，腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、分化程度、TNM分期、血清GABPA表達水平與結直腸癌患者總生存率相關(P<0.05)。多變量Cox回歸分析顯示，GABPA低表達是結直腸癌患者的預后的獨立危險因素(HR=2.813，95%CI1.035～4.911，P=0.013)，見表2。

3 討 論

結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是導致癌癥相關死亡的第三大原因。每年全世界有超過60萬人因結腸癌死亡[5-7]。盡管結腸癌在治療方面取得了巨大進展，但由于其易轉(zhuǎn)移，結腸癌的預后仍然很差[2]。因此，尋找有效可行的評估結腸癌預后的分子標志物極其重要。

GABPA在胚胎發(fā)育、先天性免疫、獲得性免疫、骨髓和造血干細胞分化中發(fā)揮作用[8-12]。研究表明,GABPA在膀胱癌、黑色素瘤、膠質(zhì)母細胞瘤中可以選擇性結合于突變的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)啟動子產(chǎn)生的ETS轉(zhuǎn)錄因子結構域，從而激活TERT表達，促進腫瘤進展[13-14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，GABPA可通過調(diào)控激酶互作的序列域(KIS)的表達抑制血管平滑肌細胞的遷移[15]。因此，GABPA對癌細胞遷移和侵襲的作用可能具有組織特異性，并且可能涉及不同細胞中的不同信號傳導途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)，GABPA蛋白在結腸癌組織中顯著低表達，而在癌旁組織中高表達，提示GABPA在結直腸中可能作為抑癌基因參與了結腸癌的發(fā)生，這與GABPA在其他多種類型腫瘤中低表達結果相一致。GABPA蛋白的低表達與結腸癌患者淋巴結轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移顯著相關，提示GABPA在結腸癌的發(fā)展中起到抑制作用。TNM分期越高，GABPA陽性表達率越低，提示GABPA在結腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中有重要作用。

表1 結腸癌組織GABPA表達與臨床病理特征的相關性

表2 Cox比例風險回歸模型對預后因素進行單變量和多變量回歸分析

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GABPA在結腸癌組織中低表達與淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關，且GABPA與結腸癌患者的預后密切相關，可能是結腸癌的一項新的獨立預后因子。因此，深入研究GABPA在結腸癌中的作用機制，可為結腸癌治療提供新的治療靶點。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

姜洪勝：查找文獻，完成實驗所有部分，論文撰寫；孫建華：完成部分實驗，論文指導，吳泉峰：統(tǒng)計數(shù)據(jù)；黃國全：實驗設計，論文審核