徐文藝，趙 彥，包 健，王俊杰

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010019）

黃花苜蓿（Medicago falcataL.）作為我國北方地區(qū)一種非常重要的多年生豆科牧草,具有很強的抗逆性,營養(yǎng)價值高[1]、適口性好,在改善天然草地及人工草地、改良苜蓿品種、培育抗寒品種等方面起到了重要作用[2]。研究表明,適當(dāng)?shù)姆拍撩{迫能提高黃花苜蓿的產(chǎn)量,降低雜草的競爭力。然而,許多苜蓿品種不能長期放牧,使放牧受到限制[3]。GAO等[4]在研究苜蓿耐牧性中得到己糖苷酶屬于上調(diào)基因,推測其可能在苜蓿耐牧性中發(fā)揮重要作用。

糖苷水解酶（Glycoside hydrolases,GH）是一類水解糖苷鍵的酶,它是通過內(nèi)切或外切的方式來水解各種含糖化合物的糖苷鍵,從而生成單糖、寡糖或糖復(fù)合物。β-氨基己糖苷酶（β-Hexosaminidase,β-Hex1）屬于GH20家族成員,作為一種常見的糖苷酶,廣泛存在于生物界中[5]。氨基糖苷酶起著調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的作用[4],該蛋白通過除去許多核和細(xì)胞質(zhì)中的絲氨酸和蘇氨酸殘基中的O-GlcNAc單糖來參與營養(yǎng)響應(yīng)的己糖氨基糖苷酶信號通路[4,6]。而O-GlcNAc單糖的去除極大地改變了動物和植物中靶蛋白的功能。而在這個過程中受到影響的植物蛋白會影響芽的生長發(fā)育、細(xì)胞分裂素分解代謝和干旱響應(yīng)[7-8]。本研究對黃花苜蓿中的耐牧相關(guān)基因Mfβ-Hex1進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析,旨在為進(jìn)一步研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

植物材料為野生的黃花苜蓿,采集于呼倫貝爾市鄂溫克旗草原站。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA的合成 取黃花苜蓿的新鮮葉片為原料,利用普洛麥格公司的植物總RNA提取試劑盒來提取黃花苜蓿的RNA,測定其質(zhì)量和濃度。再取5 μL,利用普洛麥格公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。

1.2.2 基因克隆 根據(jù)已知的目的基因序列利用NCBI primer設(shè)計特異性引物,引物序列如下：Mfβ-Hex1-F 5′TTGCGGGGATTAGAGACGTT3′,Mfβ-Hex1-R 5′TTTCGCAACAGCCTTTGCAC3′以黃花苜蓿的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增。擴增體系為：cDNA 模板 3 μL、上下游引物各 2 μL,2×Taq MasterMix 25 μL,ddH2O 18 μL。擴增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min,95℃變性 30 s,56℃退火30 s,72℃延伸70 s,30個循環(huán),72℃延伸7 min,4℃保溫。用1%的凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。

1.2.3 PCR產(chǎn)物回收 PCR的產(chǎn)物利用天根膠回收試劑盒進(jìn)行回收。將回收的產(chǎn)物3 μL與pGEM-T載體進(jìn)行連接反應(yīng),反應(yīng)時長為16 h。連接成功后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,然后用涂布器涂抹在加有氨芐青霉素的LB平板上,37℃過夜培養(yǎng),挑取生長良好的單克隆菌落溶于10 μL無菌水中,取2 μL菌液進(jìn)行菌液PCR鑒定,反應(yīng)體系為20 μL,包括菌液 2 μL,上下游引物各 1 μL,2×Taq MasterMix 10 μL,ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件同上述PCR擴增。用0.8%的凝膠電泳檢測結(jié)果。選擇陽性菌株送北京六合華大基因研究中心進(jìn)行測序。

1.2.4 黃花苜蓿Mfβ-Hex1基因的生物信息學(xué)分析 利用 NCBI Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對黃花苜蓿Mfβ-Hex1基因進(jìn)行同源性分析,利用 ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orf-finder/）和 ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對該基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測,利用 THMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域,利用TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）進(jìn)行信號肽預(yù)測,用Psort（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位,通過PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）進(jìn)行Mfβ-Hex1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物總RNA的提取與質(zhì)量檢測

提取總黃花苜蓿RNA,結(jié)果檢測有3條帶（圖1）,說明提取RNA質(zhì)量良好,可以進(jìn)行下一步實驗。

圖1 黃花苜?？俁NA檢測結(jié)果

2.2 Mfβ-Hex1 基因的克隆

使用苜蓿的cDNA作為模板,以特定的引物PCR擴增目的基因。電泳結(jié)果顯示：產(chǎn)生大約750 bp的單一條帶,與預(yù)期片段的大小一致（圖2）。

2.3 Mfβ-Hex1 序列分析

圖2 Mfβ-Hex1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

表1 Mfβ-Hex1編碼氨基酸及其含量

2.3.1 Mfβ-Hex1序列分析 利用ORF Finder結(jié)果顯示從黃花苜蓿中克隆得到長786 bp的Mfβ-Hex1基因 ,獲得675 bp的完整開放閱讀框（圖3）,編碼了224個氨基酸,將其命名為Mfβ-Hex1,利用ProtParam對該蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示,蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量約為26.02 kD,理論等電點為5.43,其氨基酸組成見表1。其中,Glu（8.0%）、Ser（7.1%）、Leu（7.1%）、Lys（6.7%）、Ile（6.2%）、Pro（6.2%）含量較高,占全部組分的41.3%。不穩(wěn)定系數(shù)為48.54,說明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。利用InterProScan保守結(jié)構(gòu)域在線軟件對該蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測（圖4）,Mfβ-Hex1屬于糖苷水解酶超家族中的一類酶,具有糖苷水解酶家族GH20的功能域。

圖3 Mfβ-Hex1開放閱讀框序列及推測氨基酸序列

圖 4 Mfβ-hex1 結(jié)構(gòu)域

2.3.2 Mfβ-Hex1跨膜區(qū)域預(yù)測及亞細(xì)胞定位 用THMM預(yù)測該蛋白質(zhì)無跨膜區(qū)域。用TargetP分析得SP值為0.498,小于1,推測此蛋白質(zhì)無信號肽。用Psort進(jìn)行亞細(xì)胞定位,預(yù)測結(jié)果顯示,Mfβ-Hex1定位于細(xì)胞質(zhì)中的可能性為64.2%,在葉綠體和細(xì)胞核中的可能性為14.3%,在線粒體中的可能性為7.1%。因此,推測Mfβ-Hex1定位于細(xì)胞質(zhì)中（表2）。

表2 Mfβ-Hex1的亞細(xì)胞定位

2.3.3 Mfβ-Hex 1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）進(jìn)行Mfβ-Hex1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,結(jié)果顯示：Mfβ-Hex1的二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主,β-折疊和無規(guī)則卷曲出現(xiàn)的概率較小（圖5）。

圖5 Mfβ-Hex1蛋白的二級結(jié)構(gòu)

2.4 Mfβ-Hex1 同源性分析

通過NCBI Blast對 Mfβ-Hex1進(jìn)行同源性分析,結(jié)果顯示：Mfβ-Hex1基因與蒺藜苜蓿β-Hex1（登錄號XP_013447851.1）的同源性最高,為98%,與鷹嘴豆β-Hex1（登錄號XP_004492083.1）的同源性為91%,與大豆β-Hex1（登錄號XP_003518662.1）的同源性為89%,與狹葉羽扇豆β-Hex1（登錄號XP_019455352.1）的同源性為87%,與木豆β-Hex1（登錄號XP_020231932.1）的同源性為90%,與煙草β-Hex1（登錄號XP_019245516.1）的同源性為85%。

2.5 遺傳距離與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用 MEGA7.0對Mfβ-Hex1與 GenBank中部分植物β-Hex1蛋白的遺傳距離進(jìn)行分析（圖6）,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖7）,從遺傳距離可以看出,黃花苜蓿Mfβ-Hex1與蒺藜苜蓿的進(jìn)化距離為0.022,說明兩種物種遺傳關(guān)系最近。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,黃花苜蓿Mfβ-Hex1與蒺藜苜蓿的β-Hex1屬于同一分支,兩者親緣關(guān)系較近。

圖6 黃花苜蓿Mfβ-Hex1蛋白的遺傳距離

圖7 Mfβ-Hex1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

3 討論

GH20基因家族一直是人們研究的熱點之一。此外,GH20基因家族存在于許多物種中,在進(jìn)化過程中表現(xiàn)出其保守性和穩(wěn)定性?；驈?fù)制、重組和序列變異被稱為生物進(jìn)化的3個基本來源,對于研究GH20基因家族的起源和進(jìn)化具有重要意義。

β-氨基己糖苷酶屬于糖苷水解酶GH20家族,是一種普遍存在于生物圈中的常見糖苷水解酶。在高等植物中的研究較少,植物糖蛋白主要包含兩類低糖鏈：寡甘露糖 N-聚糖（paucimannosidic N-glycans）和復(fù)雜N-聚糖（complex N-glycans）,絕大多數(shù)植物的糖蛋白含有大量的寡甘露糖N-聚糖[9]。在擬南芥中,β-hex分布于亞細(xì)胞的不同部位,并且在寡甘露糖N-聚糖的合成過程中起到關(guān)鍵作用[10]。β-hex屬于N-聚糖加工酶,它在植物中廣泛存在,催化位于N-糖蛋白非還原性末端的N-acetylglucosamine（GlcNAc）降解,使N-糖蛋白攜帶的complex N-glycans變?yōu)楣迅事短荖-聚糖。游離N-聚糖參與果實軟化調(diào)節(jié)[11],JAGADEESH等[12]也認(rèn)為β-hex可能作用于細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜上的糖蛋白,釋放游離N-聚糖,影響細(xì)胞壁的完整性。曹麗軍[9]在研究沙紅桃果實軟化作用中提到,β-Hex在植物中可能存在負(fù)面的調(diào)節(jié)作用,而植物免疫系統(tǒng)對于該酶也具有相應(yīng)的響應(yīng)機制。但在WANG等[13]的研究中提到,在苜蓿中的β-氨基己糖苷酶通過除去許多核和細(xì)胞質(zhì)中的絲氨酸、蘇氨酸殘基中O-GlcNAc單糖參與營養(yǎng)響應(yīng)的己糖酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶（OGT）和O-GlcNAcase（己糖氨基糖苷酶）分別加入和去除O-GlcNAc結(jié)構(gòu),極大地改變了動物和植物中靶蛋白的功能。許多受此過程影響的植物蛋白,如赤霉素信號通路涉及的那些蛋白影響著芽的生長和發(fā)育、細(xì)胞分裂素分解代謝和干旱反應(yīng),說明該基因可能參與了赤霉素和細(xì)胞分裂素的合成。本研究從黃花苜蓿中克隆得到黃花苜蓿的β-氨基己糖苷酶基因,屬于GH20家族具有糖苷水解酶家族GH20的功能域,由于在不同的生物體內(nèi)含有多個β-氨基己糖苷酶參與不同的生理過程,功能也不同,所以該基因在黃花苜蓿中的具體功能還需要進(jìn)一步的鑒定。

4 結(jié)論

本研究首次從黃花苜蓿中獲得β-氨基己糖苷酶Mfβ-Hex1基因全長786 bp,包含675 bp的開放閱讀框。編碼了224個氨基酸,主要由谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸等組成。與豆科植物蒺藜苜蓿和鷹嘴豆中的β-Hex1基因具有高度同源性。Mfβ-Hex1基因?qū)儆贕H20家族成員,不具有跨膜區(qū)域,其二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。亞細(xì)胞定位證明主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。