李歡歡 李肖甫 智艷芳 榮守華 李雅 樊婷婷 杜沛霈

宮頸癌是女性癌癥患者死亡的第二大原因，尤其在20～39歲年齡段表現更為突出，僅次于乳腺癌。因此，多數學者強調提高該年齡段人群篩查率，同時增加人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）疫苗接種率［1］。宮頸癌是目前唯一能夠經早期篩查被發(fā)現，并通過醫(yī)學干預使發(fā)病率和病死率降低的婦科惡性腫瘤，其中手術治療是早期宮頸癌的最佳選擇，臨床分期、腫瘤分化程度、盆腔淋巴結轉移情況是影響手術治療預后的重要因素［2］。目前有研究已證實，高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）持續(xù)感染是導致宮頸上皮內病變和宮頸癌的主要原因［3］，而早期發(fā)現和治療宮頸癌前病變的關鍵在于進行宮頸癌篩查。然而細胞學檢查的敏感度較低，HPV檢測的特異度較低，導致臨床不必要的轉診和治療，增加了患者的心理負擔和醫(yī)療保健的成本。

目前已發(fā)現，在宮頸癌的形成過程中伴隨著p16INK4a表達上調，宮頸癌前病變與p16INK4a蛋白過度表達密切相關。2012年下生殖道相關鱗狀上皮病變命名標準化項目（the lower anogenital squamous terminology standardization，LAST）和2014年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）均建議將p16INK4a過度表達作為判斷高度鱗狀上皮內病變（high-grade squamous intraepitheial lesion，HSIL）或宮頸癌的重要指標［4-5］。對于宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）2級病例，應用p16INK4a免疫細胞化學染色區(qū)分HSIL和低度鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepitheial lesion，LSIL），而不能僅以形態(tài)學進行鑒別。目前，p16INK4a染色在組織學中應用較普遍，而細胞學的相關報道較少，且大多采用手工染色，技術方法和結果判讀無固定標準，研究結果相差較大。本研究選擇2017年9月—2018年11月在本院參加宮頸癌篩查的970例婦女作為研究對象，利用統一細胞免疫標記染色全自動儀器進行檢測，旨在通過大樣本臨床試驗驗證p16INK4a染色可提高宮頸癌前病變診斷的準確性，降低誤診率和漏診率，從而提高臨床治療效果。

1 資料與方法

1.1 觀察對象 選擇2017年9月—2018年11月在鄭州大學第三附屬醫(yī)院婦科門診和病房參加宮頸癌篩查，并同時進行細胞學和HR-HPV檢測的1 100例婦女作為觀察對象，年齡20～65歲，中位年齡44歲；均為受試時未懷孕、無骨盆放射治療史的已婚婦女；細胞病理和組織病理兩項檢查時間間隔在1個月內。本研究符合醫(yī)學倫理學標準，所有參與者均被告知詳細研究細節(jié)并知情同意。所有數據均經處理，以保護患者隱私。

1.2 分組 將細胞學〔無明確診斷意義的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASC-US）及以上〕和 HR-HPV（14種高危型至少1種陽性）至少一項異常的婦女作為實驗組，再根據細胞學及HR-HPV檢測結果分為A、B、C組，A組宮頸細胞學和HR-HPV均為陽性，B組宮頸細胞學陽性、HR-HPV陰性，C組宮頸細胞學陰性、HR-HPV陽性。細胞學和HR-HPV均為陰性，因其他婦科良性子宮疾?。ㄈ鐭o生育要求而癥狀嚴重的子宮肌瘤、子宮內膜異位癥、子宮腺肌病等）行子宮切除術的婦女作為對照組。

1.3 方法 受檢者均參加宮頸癌篩查，同時行細胞學和HR-HPV檢測，并留存細胞學標本進一步行自動化p16INK4a免疫細胞化學染色，追蹤組織學結果。

1.3.1 p16INK4a免疫細胞化學自動化染色 檢測p16INK4a蛋白在宮頸細胞學中的表達情況，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3.1.1 儀器與試劑 自動化統一細胞免疫標記染色機、振蕩器、顯微鏡，p16試劑（Anti-CDKN2A/p16INK4a），均購自廣州江元醫(yī)療科技有限公司；抗體購自Abcam（Cambridge，MA，USA）；清洗液（分為A、B、C），緩沖液 PBS-X（10 s）、緩沖液 PBS-T（10 s），免疫顯色試劑（封閉液、P1液、P2液、抗體稀釋液、DAB顯色液、DAB稀釋液、質控片），蘇木素染液。

1.3.1.2 結果判定 由兩位細胞診斷醫(yī)師評估認定p16INK4a免疫細胞化學染色結果。p16INK4a著色部位為細胞核或細胞質，染色呈黃色或棕黃色者為陽性，與背景幾乎相同者為弱陽性，細胞質局限染色者為陰性。根據Wentzensen等［6］提出的4項核評分標準（細胞核/細胞質比增加、染色質顆粒增多、核形態(tài)不規(guī)則、無核狀態(tài)）對p16INK4a陽性細胞進行詳細評價，核評分＞2分為陽性。其中無p16陽性細胞者，評分0分；p16陽性細胞無任何核改變跡象，評分1分；僅表現上述標準之一的輕度核異常細胞，評分2分；細胞核/細胞質比增加（＞50%），加另外1項陽性標準，評分3分；所有細胞的細胞核/細胞質比均增加，加另外至少2項陽性標準，評分4分。根據p16陽性細胞的分布模式，將其進一步分為片狀、斑片狀和單細胞3種類型。片狀細胞組由分布為片狀團簇的細胞組成，大部分細胞呈陽性；斑片狀組由分布為交替簇的染色呈陽性或陰性的少數陽性細胞組成；單細胞組由單個陽性細胞組成［7］。

1.3.2 細胞學檢查 細胞學檢查采用ThinPrep 2000（美國Cytyc公司）液基薄層細胞自動制片機制片，利用細胞學診斷后剩余標本進一步行細胞免疫標記染色法檢測并另外制片。對細胞學診斷不一致的病例進行回顧性診斷分析，排除人為因素；由兩位高年資細胞病理醫(yī)師采用雙盲法診斷，兩者診斷結果一致方可納入統計分析。根據2014年修訂的TBS系統進行結果判讀，分為ASC-US、LSIL、不能排除HSIL不典型鱗狀細胞（atypical squamous cells-cannot exclude HIS，ASC-H）、HSIL、鱗狀細胞癌（squamous cell cancer，SCC）、未見上皮內病變細胞和惡性細胞（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM，包括霉菌、滴蟲感染）。

1.3.3 HR-HPV檢測 采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）+導流雜交法，試劑盒由PCR試劑、雜交試劑兩部分組成，應用基因擴增技術及導流雜交原理，以凱普醫(yī)用核酸分子快速雜交儀為平臺，通過反向點雜交檢測擴增產物與包被有型特異性探針膜雜交結果。該方法可以檢測14種最常見高危型 HPV（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型）。試劑購自凱普生物科技有限公司，嚴格按說明書操作。根據HR-HPV感染類型分為HR-HPV陰性、其他12種HR-HPV陽性和HPV16/18陽性（HPV16型或HPV18型任一陽性）。

1.3.4 陰道鏡及組織病理學檢查 細胞學篩查異常者（如細胞學ASC-US伴HPV檢測陽性、兩次細胞學連續(xù)常規(guī)篩查均為ASC-US、細胞學為LSIL及以上、HPV 16/18陽性），均行陰道鏡檢查和宮頸活檢。組織學診斷由本院3位經驗豐富的病理學專家進行顯微鏡下組織學診斷，組織學活檢結果按2014年世界衛(wèi)生組織出版的《女性生殖器官腫瘤組織學分類（第4版）》［5］標準分為良性（無病理改變和良性或反應性改變）、LSIL（CIN1和 p16陰性的 CIN2）、HSIL（p16陽性的CIN2、CIN3、原位癌或腺鱗癌）和SCC。

1.4 統計學方法 應用SPSS 21.0軟件進行統計分析，p16INK4a染色與HR-HPV感染的關系采用非條件Logistic回歸分析，不同HR-HPV感染型和病理診斷的p16INK4a陽性率比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。對p16INK4a染色結果進行診斷試驗評價，計算敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本情況 由于130例未追蹤到病理結果（部分細胞學ASC-US或為LSIL，HR-HPV陰性者未做陰道鏡下活檢，部分失訪），最終970例婦女納入研究。其中625例細胞學檢查陰性，345例細胞學檢查陽性（ASC-US及以上級別）；434例HR-HPV陽性（14種高危型任一型陽性），536例HR-HPV陰性。

2.2 p16INK4a染色與HR-HPV感染的關系 HR-HPV總陽性率為44.74%（434/970），p16INK4a染色總陽性率為24.74%（240/970）。實驗組HR-HPV陽性率為80.37%（434/540），其中A、B、C組p16INK4a染色陽性率分別為63.18%（151/239）、26.42%（28/106）、22.05%（43/195），A組較B、C組明顯升高（均P＜0.01），B組與C組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。p16INK4a染色陽性時，實驗組和對照組的p16INK4a染色陽性率分別為92.50%（222/240）和7.50%（18/240），差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 對照組以及不同TCT、HR-HPV檢測結果實驗組各組的p16INK4a染色陽性率

HR-HPV陰性組、其他12種HR-HPV陽性組和HPV16/18陽性組的p16INK4a陽性率依次為8.58%（46/536）、33.46%（86/257）、61.02%（108/177），呈遞增趨勢（χ2＝210.37，P＜0.01）。非條件Logistic回歸分析顯示，p16INK4a在其他12種HR-HPV陽性組和HPV16/18陽性組中的表達風險均明顯高于HPV陰性組〔OR值分別為 5.36（95%CI＝3.60～7.98）、16.67（95%CI＝10.88～25.56），均P＜0.01〕。見表2。

表2 不同HR-HPV感染類型各組的p16INK4a染色陽性率

2.3 p16INK4a染色在不同細胞學診斷分級中的表達 實驗組和對照組的p16INK4a染色陽性率分別為41.11%（222/540）、4.19%（18/430）。970例受檢者中，NILM 625例（64.43%），ASC 201例（20.72%，ASC-US 120例和ASC-H 81例），LSIL 59例（6.08%），HSIL及以上85例（8.76%，HSIL 83例和SCC 2例），p16INK4a染色陽性率分別為9.76%、35.59%、43.28%、83.53%；細胞學異常組的p16INK4a染色陽性率為51.88%（179/345）。隨細胞學診斷級別升高，p16INK4a染色陽性率逐漸升高（χ2＝260.02，P＜0.01），且染色強度逐漸增強。見表3，圖1。

表3 p16INK4a染色與細胞學之間的關系

圖1 p16INK4a免疫細胞化學染色細胞（高倍放大）

2.4 p16INK4a免疫細胞化學染色與對應細胞學及病理組織學的關系 對照組共納入430例，p16INK4a染色陽性率為4.19%（18/430）。良性組織病理組428例（包括濕疣樣變、慢性宮頸炎、宮頸息肉等），CIN2 2例；良性組織病理組和異常組織病理組p16INK4a染色陽性率分別為3.74%（16/428）、100%（2/2）。實驗組共納入540例，良性372例，p16INK4a染色陽性率為20.16%（75/372）；LSIL 37例（包括CIN1 33例，p16陰性CIN2 4例），p16INK4a染色陽性率為54.05%（20/37）；HSIL組127例（包括p16陽性CIN2 39例，CIN3 88例），p16INK4a染色陽性率為96.85%（123/127）；SCC 4例，p16INK4a染色陽性率為100%（4/4）。

以組織學為金標準，良性組p16INK4a染色陽性率為 11.38%（91/800），病理異常組 p16INK4a染色陽性率為87.65%（149/170），隨宮頸病變程度加重p16INK4a染色陽性率逐漸升高，差異有統計學意義（χ2＝428.20，P＜0.01）。HSIL組、SCC組的p16INK4a染色陽性率均明顯高于良性組和LSIL組（均P＜0.05）；HSIL組與SCC組之間的p16INK4a比較差異無統計學意義（P＞0.05）。4例SCC中，1例細胞學診斷為ASC-H，p16INK4a染色陽性；129例HSIL中，60例細胞學診斷與組織學診斷一致，p16INK4a染色陽性率為96.90%（125/129）；在診斷宮頸SCC和HSIL時，p16INK4a染色與細胞學比較差異有統計學意義（P＜0.05）；在LSIL和良性組中，p16INK4a染色與細胞學診斷差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 p16INK4a免疫細胞化學染色與對應細胞學及病理組織學的關系

2.5 p16INK4a、細胞學和HR-HPV檢測在宮頸HSIL+中的篩查價值 以組織學為金標準，p16INK4a染色診斷HSIL+的敏感度和特異度分別為96.99%和86.74%，均優(yōu)于HR-HPV檢測（90.98%、62.60%）和細胞學（86.47%、72.52%）。見表5。

表5 p16INK4a、細胞學和HR-HPV對HSIL+篩查的敏感度、特異度、陽性預測值及陰性預測值

3 討論

宮頸癌是婦科惡性腫瘤的常見癌癥之一，其產生原因為HR-HPV持續(xù)感染，尤其以HPV 16型和18型最常見且風險最高。目前，宮頸癌篩查主要依賴宮頸脫落細胞學和HPV-DNA檢測，但上述兩種篩查方法均有局限性。細胞學檢查的敏感度較低、假陰性率較高，且細胞學醫(yī)師的培養(yǎng)過程漫長；而HPV-DNA檢測雖敏感度有所提高，但特異性較差，不能確定HPV感染者的宮頸病變情況是否有進一步發(fā)展的風險。因此，當務之急是尋找能夠預測宮頸病變發(fā)展趨勢的早期指標或輔助診斷指標，從而在病毒持續(xù)感染者中準確找出宮頸癌高?；颊撸_到精準防治腫瘤的目的，減輕患者心理及經濟負擔。

p16INK4a是位于染色體9p21上的CDKN2a腫瘤抑制基因編碼的蛋白質，p16INK4a蛋白與CDK4/6結合并維持pRb處于低磷酸化狀態(tài)，后者又與E2F轉錄因子結合并阻止細胞增殖周期由G1期向S期轉化和DNA合成的啟動［8］。宮頸癌的發(fā)生是一個復雜的過程，HR-HPV持續(xù)感染是主要致病因素，可能的機制為當宿主持續(xù)感染HR-HPV后，HR-HPV的DNA整合進入宿主細胞基因組，導致E6和E7病毒基因產生癌蛋白。E6降解p53，E7結合pRb并使其失活，導致pRb喪失對p16INK4a基因的負反饋抑制作用，p16INK4a蛋白呈過表達［9-12］，最終驅動細胞死亡和細胞凋亡。上述現象也可在一些正常細胞中觀察到，如衰老細胞、鱗狀化生細胞及萎縮細胞。

研究表明［13-14］，p16INK4a基因及其表達產物在大部分腫瘤組織中缺失或低表達，而在宮頸上皮內病變及宮頸癌組織中的表達量和范圍則隨宮頸級別的升高而逐漸增加。p16INK4a被認為是HR-HPV感染轉化的生物標記物，p16INK4a陽性表達程度也可用于判斷HR-HPV感染程度，p16INK4a陰性表明病變處于非異型增生狀態(tài)，而p16INK4a陽性則表明病變處于異型增生相?？紤]到僅少數LSIL病例可進展為更高級的病變，p16INK4a陽性可能對指導低風險的絕經婦女和青少年患者進行更密切的隨訪或進一步評估有一定實用價值。迄今為止，已有研究提示p16INK4a作為一種生物標志物在宮頸細胞學涂片中發(fā)現異常細胞的可行性［15-19］。目前p16INK4a染色在組織學中應用較普遍，而在細胞學中報道較少，且?guī)缀蹙鶠槭止と旧?，染色時間長短不一，操作人員水平良莠不齊，技術方法和結果判讀無固定標準，報道結果相差較大。本研究采用自動化統一免疫標記染色機，制片及染色步驟更標準化，避免了操作者差異對實驗結果的影響，具有較好的可重復性和診斷準確性。

本研究結果表明，p16INK4a在HR-HPV陽性人群中的表達高于HR-HPV陰性人群，且p16INK4a在HPV16/18陽性組中的表達風險是其他12種HRHPV陽性組的3倍，與既往研究結果一致［20］，提示p16INK4a表達與HR-HPV感染有關。

Bergeron 等［21］研究發(fā)現，p16INK4a診斷篩查人群 HSIL+的敏感度為 86%；Carozzi等［22］研究顯示，篩查人群中p16INK4a免疫染色的橫斷面敏感度為88%；本研究中p16INK4a免疫細胞化學染色診斷HSIL+的敏感度為96.99%，特異度為86.74%（可能與具有良好形態(tài)學基礎的細胞學專家閱片有關），均高于HR-HPV和細胞學檢測。

本研究中，實驗組和對照組的p16INK4a染色陽性率比較差異有統計學意義，雖然對照組出現少量p16INK4a染色陽性，但其核評分多集中在1～2分，而實驗組則集中在3分及以上。細胞學和組織學結果均顯示，隨宮頸病變程度加重，p16INK4a染色陽性率及核評分均明顯升高，說明p16INK4a染色程度與宮頸高級別病變的發(fā)生密切相關，p16INK4a染色評分越高，進展為宮頸癌的風險越大。臨床工作中，由于HSIL的細胞形態(tài)和萎縮細胞有時非常相似，僅根據形態(tài)學進行細胞診斷可能是一個挑戰(zhàn)，尤其當萎縮細胞出現深色擁擠群（Hyperchromatic crowded groups，HCGs）細胞時很容易被誤認為是HSIL。本研究800例良性病變中，69例僅通過細胞學檢查被誤認為是HSIL（13例）和ASC-H（32例），但其中有45例通過p16INK4a染色結合細胞學檢查被正確識別，因此p16INK4a免疫染色不僅可作為宮頸HSIL或更嚴重病變的輔助診斷工具，也有助于判斷LSIL和良性病變，從而減少不必要的陰道鏡轉診。

本研究顯示，p16INK4a染色具有以下幾個優(yōu)點：① 陰性預測值和特異度高；② 經濟實惠，p16INK4a染色陽性即可提示早期宮頸上皮內病變，相比于p16INK4a/Ki-67雙染經濟實惠，且實驗人員更好把控；③ 自動化染色標準快速，易于操作。本研究利用全自動免疫細胞化學染色儀器，每批可同時檢測24例樣本，兩批樣本間隔時間僅為3.5 h（手工免疫細胞化學染色加一抗后需4 ℃過夜）。另外，細胞學閱片主要依據細胞形態(tài)學，由于經驗不足和任務量大，細胞學檢查醫(yī)師常易漏診一些可能發(fā)展為癌前病變甚至宮頸癌的患者，導致假陰性率升高；而p16INK4a染色在顯微鏡下根據顏色差異即可快速識別異常細胞，非專業(yè)技術人員可以在短期內掌握，比較適用于診斷水平和異常結果檢出率低的經濟欠發(fā)達地區(qū)大樣本量的宮頸癌篩查。

本研究局限性：① 與國外研究相比，入組的研究對象樣本量偏少，研究結果可能存在偶然性因素；② 對細胞學異常和HR-HPV陽性者陰道鏡依從率較高，兩種檢查結果正常而僅p16INK4a陽性者大部分無隨訪病理結果，可能會使p16INK4a的特異度升高。因此，為全面篩查目標人群的宮頸情況以及精確評估p16INK4a的臨床價值，應加強對單純p16INK4a陽性者的隨訪管理，以早期發(fā)現潛在宮頸病變；此外，應通過媒體廣泛宣傳宮頸健康知識，提高宮頸癌疫苗的接種率，使目標人群自覺接受并重視宮頸癌篩查，以提高陰道鏡依從率，降低宮頸癌發(fā)病率；最后，當細胞學、HR-HPV檢測和p16INK4a染色任一結果陽性時均建議進一步行陰道鏡檢查，從而避免診斷偏倚，更加客觀、準確地比較其單獨的敏感度和特異度。

綜上所述，自動化p16INK4a免疫細胞化學染色可在一定程度上提高宮頸癌篩查的敏感度和特異度，減少漏診和過度診斷，對臨床診療有較好的輔助分流價值，能夠降低早期宮頸癌及癌前病變的發(fā)生率，減輕患者的經濟負擔，有較好的應用前景。