佘志成，李 群，王 凱，郎秀艷，宋慶慶*

（1.金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2.揚(yáng)州優(yōu)邦生物藥品有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225008）

偽狂犬病是一種由偽狂犬病毒感染引起的多種家畜和野生動(dòng)物共患的急性、熱性傳染病，除豬以外的其他動(dòng)物均呈致死性感染，豬是偽狂犬病毒的唯一自然宿主。我國(guó)于20世紀(jì)70年代由哈爾濱獸醫(yī)研究所從匈牙利引進(jìn)了偽狂犬疫苗Bartha-k61株，自20世紀(jì)90年代以來(lái)國(guó)內(nèi)規(guī)?；i場(chǎng)普遍使用該基因缺失疫苗，使豬偽狂犬病得到了很好的控制。但是2011年以后，一種由偽狂犬病毒變異毒株引起的豬偽狂犬病在我國(guó)暴發(fā)，造成大量母豬繁殖障礙、100%初生乳豬死亡率以及育肥豬嚴(yán)重的呼吸道問(wèn)題，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損[1-3]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)間接 ELISA 方法檢測(cè)豬群中的 gE 抗體來(lái)鑒定豬群是否被偽狂犬病野毒感染，對(duì)豬偽狂犬病gE陰性場(chǎng)檢測(cè) gB 抗體來(lái)判定豬群的豬偽狂犬病抗體保護(hù)水平，由此系統(tǒng)調(diào)查分析江蘇地區(qū)豬偽狂犬病的流行情況，并在一存欄1 000頭左右經(jīng)產(chǎn)母豬的豬偽狂犬病陽(yáng)性豬場(chǎng)嘗試使用最新上市的變異株活疫苗與抗原含量最高的進(jìn)口產(chǎn)品相比控制豬偽狂犬病效果，通過(guò)檢測(cè)豬偽狂犬病gE，gB抗體及中和抗體評(píng)估偽狂犬病的控制效果，為進(jìn)一步開(kāi)展豬偽狂犬病的綜合防治以及豬偽狂犬病凈化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

被檢血清樣品共4 608份，從2017年5月至2019年1月采集自江蘇地區(qū)59個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)，其中種豬群1 521份樣品、仔豬群1 901份樣品、育肥豬群896份樣品，后備豬群290份樣品分別檢測(cè)豬偽狂犬病gE、gB抗體。

1.2 試劑及儀器

豬偽狂犬病gE抗體ELISA試劑盒（西班牙Hipra）和豬偽狂犬病gB抗體檢測(cè)試劑盒（荷蘭BioChek）均購(gòu)自北京天之泰生物科技有限公司；Eppendorf 移液器、酶標(biāo)儀、生化培養(yǎng)箱、洗板機(jī)、TGL-16G 高速臺(tái)式離心機(jī)、二氧化碳培養(yǎng)箱、渦旋振蕩器；偽狂犬病變異毒株YB-1、偽狂犬病經(jīng)典毒株HB-G株，ST細(xì)胞由揚(yáng)州優(yōu)邦生物藥品有限公司保存。兩種疫苗均為商品化疫苗，A 組疫苗為進(jìn)口產(chǎn)品，毒株為 Barth-K61 株，批號(hào)L447801；B 組疫苗為國(guó)內(nèi)分離雙基因缺失株C株，江蘇某公司生產(chǎn)，批號(hào)17251001。

1.3 疫苗免疫

疫苗免疫實(shí)驗(yàn)自2018年7月至2019年1月，在江蘇地區(qū)一存欄1 000頭左右母豬場(chǎng)進(jìn)行，該場(chǎng)在本次流行病學(xué)調(diào)查中判斷為豬偽狂犬病陽(yáng)性活躍場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)分A、B組進(jìn)行，免疫程序?yàn)樾律胸i滴鼻1頭份，10周齡、14周齡、18周齡肌肉注射1頭份；首次肌肉注射時(shí)A組408頭，B組435頭。

1.4 ELISA及中和抗體檢測(cè)

兩實(shí)驗(yàn)組分別在4周齡、6周齡、10周齡、14周齡、18周齡、20周齡、24周齡采血，分離血清ELISA檢測(cè)兩組gE、gB抗體，檢測(cè)兩組14周齡、18周齡血清測(cè)中和抗體。

1.5 測(cè)定偽狂犬病毒效價(jià)（TCID50）

ST細(xì)胞培養(yǎng)至單層后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液；將收獲病毒樣品用DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基按照10倍稀釋度連續(xù)倍比稀釋到10-9，將不同稀釋度的毒液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度做8個(gè)重復(fù)孔，每孔100 μL，吸附1 h后，加入維持液；培養(yǎng)96 h后，觀察細(xì)胞病變（CPE），記錄每個(gè)稀釋度的CPE數(shù)量，按照Reed-muench方法計(jì)算TCID50。

1.6 中和抗體測(cè)定

病毒液稀釋至200 TCID50備用；取1新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板作為稀釋板，A1-G1孔加入200 μL血清樣品（血清稀釋度1:2），其余每孔加入100 μL DMEM液，從A1孔取100 μL毒液至A2孔混勻后，再向A3孔加入100 μL混合液，按照上述方法依次倍比稀釋至第10孔，剩余兩孔設(shè)為病毒對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔，將各血清稀釋孔和病毒對(duì)照孔加入 100 μL 200 TCID50病毒液，陰性對(duì)照孔則加入100 μL DMEM液，37 °C孵育1 h后；將鋪有ST細(xì)胞的96孔板，棄去細(xì)胞液，將稀釋板上液體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞板，培養(yǎng)96 h后觀察CPE，以最高稀釋度CPE作為中和抗體效價(jià)。另做回歸實(shí)驗(yàn)，將病毒做1、10、100、1 000倍的稀釋，將稀釋后的病毒液加入細(xì)胞板中，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度做6個(gè)重復(fù)孔，另外設(shè)6個(gè)對(duì)照孔，只加入DMEM，若100倍稀釋毒孔有半數(shù)出現(xiàn)CPE，則實(shí)驗(yàn)成立。

2 結(jié)果

2.1 豬偽狂犬病 gE 抗體檢測(cè)情況

2017年5月份至2019年1月份從江蘇地區(qū)59個(gè)規(guī)模場(chǎng)進(jìn)行采樣檢測(cè)，抽檢了4 608份樣品，gE抗體陽(yáng)性樣品數(shù)1 681份，總體陽(yáng)性率達(dá)到36%，進(jìn)一步分析母豬群1 396份樣品中有642份陽(yáng)性，公豬125份樣品中g(shù)E抗體陽(yáng)性62份，種豬群的陽(yáng)性率近50%，大于120日齡的育肥豬群樣品896份，其中g(shù)E陽(yáng)性252份，gE陽(yáng)性率達(dá)28%（見(jiàn)表1），提示江蘇地區(qū)豬偽狂犬病感染較嚴(yán)重，種豬群感染率高于商品豬群，這些豬場(chǎng)均是進(jìn)行豬偽狂犬病疫苗免疫的豬場(chǎng)，但未能很好地控制偽狂犬病毒的感染。

根據(jù)《豬病學(xué)》第9版，豬偽狂犬病母源抗體持續(xù)期為4個(gè)月，由于母豬一旦感染終生帶毒，母豬及仔豬的gE抗體并不能完全代表豬場(chǎng)偽狂犬病毒的感染情況，為準(zhǔn)確評(píng)估豬場(chǎng)偽狂犬病的控制效果，我們進(jìn)一步對(duì)各個(gè)豬場(chǎng)商品豬的gE抗體也進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)于每個(gè)豬場(chǎng)根據(jù)母豬群gE陽(yáng)性與否以及商品豬陽(yáng)性與否的情況對(duì)豬場(chǎng)偽狂犬病感染情況進(jìn)行細(xì)分，發(fā)現(xiàn)豬場(chǎng)母豬及商品豬均陽(yáng)性的場(chǎng)比例達(dá)37%（見(jiàn)表2）。另對(duì)本地區(qū)8個(gè)豬偽狂犬病gE陰性場(chǎng)的gB抗體情況進(jìn)行檢測(cè)分析，總體gB陽(yáng)性率為74%，其中主要問(wèn)題在于育肥豬階段合格率偏低只有62%（見(jiàn)表3），是主要的免疫漏洞所在。

2.2 豬偽狂犬病防控實(shí)驗(yàn)前免疫程序調(diào)整

在豬偽狂犬病流行病學(xué)調(diào)查中，與江蘇一規(guī)模豬場(chǎng)場(chǎng)主進(jìn)行溝通，其表現(xiàn)強(qiáng)烈地控制本場(chǎng)豬偽狂犬病問(wèn)題的想法，基于此，制定了該場(chǎng)的豬偽狂犬病防控方案，該場(chǎng)之前使用國(guó)產(chǎn)HB2000株豬偽狂犬病疫苗未能很好解決場(chǎng)內(nèi)豬偽狂犬病問(wèn)題，檢測(cè)母豬群陽(yáng)性率gE抗體陽(yáng)性率95%，商品豬偽狂犬病gE陽(yáng)性率100%（見(jiàn)表4），實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了一次母源抗體調(diào)查（見(jiàn)表5），對(duì)豬偽狂犬病免疫程序調(diào)整為出生24 h內(nèi)滴鼻，10周齡、14周齡、18周齡3次肌肉注射。

2.3 豬偽狂犬病防控實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)估

該實(shí)驗(yàn)于2018年7月26日開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)兩組分別接種A疫苗與B疫苗于4周齡、6周齡、10周齡、14周齡、18周齡、20周齡、24周齡采血，最后一次采血為2019年1月15日，所采血樣分別檢測(cè)gE、gB抗體，兩組在18周齡后gE抗體均為陰性，表明仔豬4～14周齡gE抗體陽(yáng)性均為母源抗體持續(xù)，非感染產(chǎn)生，且18周齡后gB抗體陽(yáng)性率均為100%（見(jiàn)表6），此時(shí)的gB抗體為疫苗免疫產(chǎn)生，提示疫苗均產(chǎn)生了較好的保護(hù)，相比之前豬偽狂犬病得到了較好的控制。

2.4 中和抗體檢測(cè)結(jié)果

中和抗體是評(píng)判豬偽狂犬病疫苗免疫效果的金標(biāo)準(zhǔn)，但是檢測(cè)中和抗體費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適合大批量檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)選取首免后4周，二免后4周測(cè)中和抗體，比較兩組差異，檢測(cè)結(jié)果表明二免后4周B組無(wú)論是對(duì)變異株還是經(jīng)典株，中和抗體均優(yōu)于A組（見(jiàn)表7）。

表1 江蘇地區(qū)豬偽狂犬病 gE 抗體檢測(cè)情況

表2 江蘇地區(qū)豬場(chǎng)偽狂犬病gE陽(yáng)性比例

表3 江蘇地區(qū)8個(gè)豬偽狂犬病毒gE陰性豬場(chǎng)的gB抗體情況

3 討論

隨著變異株豬偽狂犬病毒的出現(xiàn)，傳統(tǒng)疫苗的保護(hù)效率在下降，全國(guó)各地流行病學(xué)調(diào)查均發(fā)現(xiàn)自2011年以后豬群中豬偽狂犬病毒gE抗體的比例明顯上升，同時(shí)各地均分離到豬偽狂犬病毒變異毒株[4-9]。對(duì)江蘇地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)gE抗體調(diào)查發(fā)現(xiàn)，樣品總體gE陽(yáng)性率達(dá)36%，其中種豬群的gE陽(yáng)性率達(dá)到50%，相比全國(guó)平均水平，江蘇地區(qū)豬偽狂犬病感染壓力較大。豬只一旦感染偽狂犬病病毒可終生帶毒，而仔豬母源抗體半衰期為18 d，母源抗體最長(zhǎng)持續(xù)期可達(dá)4個(gè)月，因此對(duì)于母豬群已經(jīng)是gE陽(yáng)性的父母代豬場(chǎng)，如何有效防控和正確的評(píng)估偽狂犬病的防控效果尤為重要，必須要檢測(cè)120日齡以后商品豬群的偽狂犬病gE抗體情況。本次調(diào)查也對(duì)各豬場(chǎng)育肥豬群gE抗體情況進(jìn)行了解，育肥豬群gE抗體陽(yáng)性占總育肥豬群的比例達(dá)到28%，育肥后期豬群gE抗體陽(yáng)性的豬場(chǎng)占比達(dá)到37%，江蘇地區(qū)的豬場(chǎng)血清調(diào)查揭示即使免疫了豬偽狂犬病疫苗，育肥豬群的防控效果仍不容樂(lè)觀。

表4 實(shí)驗(yàn)前豬偽狂犬病血清樣品gE、gB抗體調(diào)查

表5 豬偽狂犬病母源抗體檢測(cè)

表6 注射兩種疫苗后產(chǎn)生gE、gB抗體比較

表7 中和抗體檢測(cè)

在gE抗體陰性的情況下，gB 免疫抗體陽(yáng)性率與其中和抗體效價(jià)有一定的相關(guān)性，gB–ELISA 抗體水平可以用來(lái)評(píng)估生豬對(duì)當(dāng)前流行 PRV 毒株的相對(duì)免疫保護(hù)力[9-10]，在江蘇8個(gè)gE陰性的豬場(chǎng)我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)育肥豬階段gB抗體陽(yáng)性率62%，且S/P值相對(duì)較低，提示育肥階段為豬偽狂犬病防控一大薄弱環(huán)節(jié)，需要引起重視。

豬偽狂犬病病毒C株是國(guó)內(nèi)新近分離到的偽狂犬病毒變異株，同豬偽狂犬病病毒Bartha-k61同源性為95%～96%，與PRV Bartha-k61不屬同一個(gè)毒株[11]。中和抗體檢測(cè)是評(píng)估免疫效果的金標(biāo)準(zhǔn)，gB抗體只是中和抗體的一種，且一般認(rèn)為中和抗體大于1:2時(shí)對(duì)應(yīng)ELISA檢測(cè)gB抗體水平即為陽(yáng)性，ELISA檢測(cè)的gB抗體S/P值與中和抗體有一定相關(guān)性，為更好地評(píng)估疫苗的豬場(chǎng)使用效果，在檢測(cè)gB抗體的基礎(chǔ)上可進(jìn)一步進(jìn)行中和抗體的檢測(cè)。我們?cè)谝回i偽狂犬病陽(yáng)性的豬場(chǎng)進(jìn)行了兩組疫苗的防控效果評(píng)價(jià)，兩組在相同的免疫程序下育肥階段18周齡以后至出欄前均保持gE抗體陰性，gB抗體陽(yáng)性率100%，達(dá)到了較好的控制效果，進(jìn)一步于首免后4周，二免后4周檢測(cè)中和抗體發(fā)現(xiàn)B組在二免后無(wú)論是對(duì)經(jīng)典株還是變異株的中和抗體效價(jià)均優(yōu)于A組，差異顯著。中和抗體效價(jià)越高，對(duì)病毒的中和效果越好，對(duì)于豬偽狂犬病陽(yáng)性豬場(chǎng)，在充分了解豬群感染情況及母源抗體消減的情況下，選擇優(yōu)質(zhì)的疫苗進(jìn)行科學(xué)免疫能產(chǎn)生更高的中和抗體，取得較好的偽狂犬病控制效果為進(jìn)一步凈化豬偽狂犬病提供基礎(chǔ)。