馬秀濤 黃初生 馮 旭 黃子春 葉 超 黃宏劍 陳平偉 劉慧榮

覃家錦1*

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，南寧市 530021；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科，南寧市 530000)

肺動脈高壓是由不同病因引起的肺血管病理生理改變，以肺動脈壓力和肺血管阻力進(jìn)行性升高為主要特征，最終導(dǎo)致右心衰竭的肺循環(huán)疾病，其病理變化包括肺血管收縮與重構(gòu)、肺血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖、原位血栓形成等[1]。肺動脈高壓預(yù)后較差，死亡率較高，3年生存率<54.9%[2]。肺動脈高壓目前尚無特效治療方法，其確切機(jī)制尚未闡明。川牛膝醇提物主要以川牛膝為原料，經(jīng)過乙醇提取，大孔樹脂分離純化，硅膠柱色譜分離、結(jié)晶、干燥得到的生物堿，主要成分為牛膝甾酮等[3]。本研究通過野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型，探討川牛膝醇提物對大鼠血流動力學(xué)、肺血管的影響及機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 川牛膝醇提物由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供；成年雄性SD大鼠40只，體重(220±20)g，10周齡，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；MCT為美國Sigma公司產(chǎn)品；10%的水合氯醛購置于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(批號：1501004-WS10)；光學(xué)顯微鏡為日本Olypus電子公司產(chǎn)品；Powerlab多通道生理記錄儀為上海然哲儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法 將40只SD大鼠隨機(jī)均分為對照組、MCT組、高劑量組(川牛膝醇提物24 g/kg)、中劑量組(川牛膝醇提物12 g/kg)和低劑量組(川牛膝醇提物6 g/kg)。后4組大鼠均一次性腹腔注射MCT 60 mg/kg建立肺動脈高壓模型，對照組注射等量生理鹽水。MCT注射第28天，高、中、低劑量組分別給予相應(yīng)劑量的川牛膝醇提物灌胃，各1次/d，連續(xù)2周，對照組和MCT組分別予以等量的生理鹽水灌胃。

1.3 測量指標(biāo)

1.3.1 mPAP、RVSP和右心室肥厚指數(shù) 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行6周后，給予大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰臥固定在操作臺上，游離右頸外靜脈，采用右心導(dǎo)管法[4]，將聚乙烯導(dǎo)管經(jīng)右頸外靜脈插入大鼠肺動脈，導(dǎo)管另一端接壓力換能器及多通道生理記錄儀，測定平均肺動脈壓(mPAP)及右心室收縮壓(RVSP)。測定完血流動力學(xué)指標(biāo)后處死大鼠，取出雙肺和心臟，去除左右心房和大血管，并沿著室間隔邊緣剪下右心室、左心室及室間隔。去除血液和水分后，利用精密電子天平測量右心室、左心室和室間隔質(zhì)量。右心室肥厚指數(shù)=右心室質(zhì)量/[左心室質(zhì)量+室間隔質(zhì)量]。

1.3.2 肺小動脈中膜厚度 留取右肺上葉于液氮中保存，應(yīng)用4%多聚甲醛固定，脫水后常規(guī)石蠟包埋切片并進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察肺小動脈的形態(tài)學(xué)變化。每個樣本隨機(jī)選擇直徑25～100 μm的肺小動脈5～10根，在光學(xué)顯微鏡下分別測定血管壁內(nèi)鏡和外徑，其差值為血管壁厚度(WT)，血管壁厚度百分比(%)=(血管外徑-血管內(nèi)徑)÷血管外徑×100%。

1.3.3 血清MDA含量和SOD活性的檢測 采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)檢測MDA的含量，參照試劑盒說明書操作步驟及計(jì)算公式進(jìn)行操作和計(jì)算。采用黃嘌呤氧化酶(XOD)法檢測SOD活性，參照試劑盒說明書操作步驟及計(jì)算公式進(jìn)行操作和計(jì)算。

1.3.4 PI3K、Akt mRNA水平檢測 取50～100 mg肺組織置入1.5 mL EP管中，采取Trizol一步法提取RNA。在0.5 mL微量離心管中，加入總RNA 5 μg，補(bǔ)充適量的焦碳酸二乙酯(DEPC)水使總體積達(dá)12 μL。在管中加10 μmol/lT重復(fù)寡核苷酸(OligodT)引物溶液至15 μL，混勻、離心；70 ℃加熱10 min，立即插入冰浴中，離心，冰上加入10×PCR緩沖液2 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、10 mmol/L dNTPmix 1 μL、0.1 mol/L DTT 2 μL，混勻、離心。42 ℃孵育2～5 min。加入逆轉(zhuǎn)錄酶Ⅱ1 μL，42 ℃水浴中孵育50 min。于70 ℃加熱15 min以終止反應(yīng)。將管插入冰中，加入核糖核酸酶H 1 μL，37 ℃孵育20 min，降解殘留的RNA。-20 ℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增。取0.5 mL PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 μL；上游引物(10 pmol/L) 2 μL；下游引物(10 pmol/L)2μL；dNTP(2 mM)4 μL；10×PCR緩沖液5 μL；Taq酶(2 u/μL)1 μL。加入適量的雙蒸水(dd H2O)，使總體積達(dá)50 μL。輕輕混勻，離心。擴(kuò)增條件：94 ℃變性30 s；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸24 s，40 個循環(huán)。行瓊脂糖凝膠電泳，紫外線燈下觀察結(jié)果。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進(jìn)行密度掃描。

1.3.5 PI3K、Akt蛋白水平的檢測 取凍存的肺組織50 mg裂解后提取總蛋白。采用Westem blot檢測PI3K/Akt的表達(dá)：蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳；蛋白質(zhì)從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持體；對固定于硝酸纖維素濾膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色；封閉硝酸纖維濾膜的免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 mPAP、RVSP、右心室肥厚指數(shù)及WT百分比比較 與對照組比較，MCT組、低劑量組各指標(biāo)顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與MCT組比較，高、中劑量組各指標(biāo)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高、中劑量組與對照組比較，各指標(biāo)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組mPAP、RVSP、右心室肥厚指數(shù)及WT百分比比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與MCT組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05

2.2 血清MDA和SOD活性比較 與對照組比較，高、中、低劑量組SOD活性明顯高于對照組，MDA含量明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2(MCT組未測)。

2.3 PI3K、Akt蛋白及其mRNA的表達(dá) 與對照組比較，MCT組、低劑量組PI3K、Akt蛋白及其mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與MCT組比較，高、中劑量組PI3K、Akt蛋白及其mRNA的表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，高、中劑量組PI3K、Akt蛋白及其mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 各組血清SOD和MDA的比較

注：與對照組比較，*P<0.05

表3 各組PI3K、Akt蛋白及其mRNA的表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與MCT組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05

3 討 論

肺動脈高壓是以肺動脈系統(tǒng)循環(huán)阻力進(jìn)行性增加為特征的一組疾病，其病理變化包括肺血管收縮與重構(gòu)、肺血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖、原位血栓的形成等[5-6]，如果不予以治療，會導(dǎo)致右心衰竭，容量負(fù)荷增加直至死亡。川牛膝有一定的降壓作用，劉彥灸等[7]發(fā)現(xiàn)川牛膝提取物能降低自發(fā)性高壓大鼠血壓，其機(jī)制可能為其可降低 TGF-β1 對腎小球細(xì)胞的刺激，從而減少腎素釋放，降低血管緊張素Ⅱ生成，進(jìn)而加劇血管擴(kuò)張，降低血壓。

本實(shí)驗(yàn)采用單次經(jīng)腹腔注射野百合堿成功建立肺動脈高壓大鼠模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCT組大鼠肺動脈高壓、右心室收縮壓、右心室肥厚指數(shù)明顯高于對照 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究中，高、中劑量組可以明顯降低肺動脈壓力、右心室收縮壓，與MCT組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證實(shí)了川牛膝醇提物具有降低野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠肺動脈壓力的作用。在組織層面上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高、中劑量組肺小血管狹窄程度、肺小血管中膜厚度較MCT組有明顯改善，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。川牛膝醇提物可下調(diào)肺動脈高壓大鼠PI3K、Akt蛋白及其mRNA表達(dá)水平，以高、中劑量組下調(diào)最明顯。川牛膝醇提物可以提高大鼠血清超氧化物歧化酶活性，降低大鼠血清丙二醛含量。

肺動脈高壓病因機(jī)制十分復(fù)雜，目前研究發(fā)現(xiàn)包括氧化應(yīng)激、血管活性物質(zhì)失衡、內(nèi)皮功能障礙、遺傳傾向、原位血栓形成和炎癥等[8]。雖然肺動脈高壓的形成機(jī)制還沒有完全闡明，但是國內(nèi)外大量研究證實(shí)了氧化應(yīng)激在肺動脈高壓的病理生理中起到至關(guān)重要的作用[9-11]。肺動脈高壓中出現(xiàn)的氧化應(yīng)激包括蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化、抗氧化物質(zhì)含量降低、DNA過氧化和酶類變性[12]。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧可以作為第二信使，活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)破壞、組織損傷和器官病變，甚至導(dǎo)致癌變，也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長途徑、細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、改變轉(zhuǎn)錄因子[11]。丙二醛是脂質(zhì)過氧化中的一類終末代謝產(chǎn)物，MDA的含量可以反映出機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度。超氧化物歧化酶是清除體內(nèi)活性氧簇(ROS)的關(guān)鍵酶，也屬于人類機(jī)體內(nèi)天然的抗氧化酶，可以清除體內(nèi)自由基、參與維持機(jī)體內(nèi)自由基的平衡，從而保護(hù)機(jī)體組織細(xì)胞?；钚匝跷镔|(zhì)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與肺動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞重構(gòu)，其中涉及內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡以及肺動脈血管平滑肌細(xì)胞的增殖[13-14]。張志英等[15]研究證實(shí)牛膝抗氧化作用非常明顯。本研究發(fā)現(xiàn)川牛膝醇提物可以提高肺動脈高壓大鼠血清超氧化物歧化酶活性，降低肺動脈高壓大鼠血清丙二醛含量。川牛膝醇提物具有非常強(qiáng)的抗氧化作用，能夠保護(hù)肺小血管內(nèi)皮功能，阻止脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，從而阻止肺動脈高壓的發(fā)生。

PI3K/Akt/mTOR信號通路是惡性腫瘤細(xì)胞Warburg效應(yīng)中最重要的調(diào)節(jié)通路之一[16-17]，Warburg效應(yīng)的機(jī)制為PI3K磷酸化活化Akt，活化后的Akt可以通過mTOR上調(diào)HIF1a的表達(dá)，后者通過上調(diào)糖代謝中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)表達(dá)，從而抑制丙酮酸脫氫酶(PDH)的活性，導(dǎo)致在有氧環(huán)境下的葡萄糖代謝轉(zhuǎn)向糖酵解途徑[18]。PI3K和其相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，機(jī)制是通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)從而促使血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)川牛膝醇提物能夠降低野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈壓力，降低肺血管重構(gòu)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)肺組織PI3K/Akt信號通路有關(guān)。