王瑞英,余 飛,2,劉萬卉,2

(1.煙臺大學新型制劑與生物技術藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學),山東 煙臺 264005;2.綠葉制藥集團有限公司,山東 煙臺 264003)

核磁共振波譜(Nuclear magnetic resonance,NMR)技術是少數(shù)幾種能在原子尺度上對蛋白質的精細三維結構進行表征的技術之一,目前能對分子質量高達幾十萬的蛋白質結構進行表征[1-3]．采用15N和13C全同位素標記中等大小的蛋白質,NMR表征其結構并收錄在蛋白質數(shù)據(jù)庫(PDB)里[4-5]．對分子質量大的蛋白質(>40 kU),因NMR信號重疊及峰寬增加,全同位素標記的樣品已不能滿足NMR表征蛋白質結構的要求．另外,某些蛋白質很難獲得全同位素標記的樣品,且其標記耗費昂貴．為了克服全同位素標記的難題,發(fā)展了一系列的蛋白標記技術,其中包括選擇性標記技術,即僅對一到兩種氨基酸進行標記[6-7]．選擇性標記可以大幅度提高蛋白質中特定氨基酸的信號,達到簡化譜圖的目的．

核磁共振研究中所利用的同位素標記蛋白大多是在大腸桿菌表達系統(tǒng)中得到的．大腸桿菌遺傳背景清楚、操作簡單且表達外源基因產(chǎn)物的水平遠高于其他基因表達系統(tǒng)[8-10],是現(xiàn)階段最常用的表達系統(tǒng),也是獲得同位素標記蛋白最為經(jīng)濟的一種表達系統(tǒng)[11-12]．但大腸桿菌表達系統(tǒng)有其局限性,表達產(chǎn)物有時會形成不溶性的聚積物沉淀,稱為包涵體．包涵體蛋白通常沒有蛋白活性,需要進行變復性處理,折疊成天然結構的蛋白質[13-14]．

蛋清溶菌酶(hen egg-white lysozyme,HEL)的酶學結構、分子結構以及酶蛋白基因結構都已經(jīng)研究的很清楚,因此本文作為模型蛋白進行基礎研究．已知HEL是由129個氨基酸殘基組成的一條多肽鏈,分子質量為14.3 kU,含有4對二硫鍵,空間結構為較緊密的橢球形[15]．酪氨酸(Tyr)為芳香族氨基酸,常位于蛋白質的疏水核心,且位于配基結合的界面上,其殘基側鏈上空間約束對于大部分蛋白質空間結構的研究具有非常重要的價值．HEL含有3個Tyr,對其芳香環(huán)的13C進行標記,可以簡化核磁譜,便于重疊信號的區(qū)分,從而對酪氨酸的信號進行指認[13]．本研究利用蛋清溶菌酶對酪氨酸的選擇性標記進行了方法優(yōu)化,其中包括誘導溫度、誘導時間、誘導劑(IPTG)的誘導濃度、可溶性表達等,然后經(jīng)過分離純化,得到高純度的目標蛋白,為進一步制備選擇性標記的蛋白以及利用核磁研究蛋白質的結構與功能奠定基礎．

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株 大腸桿菌Ε.coliBL21(DE3)購自上?？蒲猩锟萍加邢薰?HEL-pET15b(含6個His標簽,酶切位點為NdeⅠ和XhoⅠ)重組質粒(圖1)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成．

圖1 重組質粒HEL-pET15b圖譜

1.1.2 試劑 酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂(OXOID)、氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司)、M9基礎鹽溶液2X(Thermo)、氨芐青霉素(北京全式金生物有限公司)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,翊圣生物)、蛋清溶菌酶、DTT、氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽、鹽酸胍、葡萄糖、氯化鈣、鹽酸鎂(Sigma)、分子質量標準蛋白Marker(Thermo)、13C6-酪氨酸(CIL)．

1.1.3 儀器 電子天平(METTLER TOLEDO)、高壓滅菌鍋(ZEALWAY)、恒溫搖床(上海知楚)、培養(yǎng)箱(上海一恒科技)、高速低溫離心機(Thermo)、電泳系統(tǒng)(Thermo)、凝膠成像儀(Bio-Rad)、核磁共振儀(Bruck 600 MHz)、紫外-可見分光光度計(Thermo NanoDrop 2000)．

1.2 單菌落的培養(yǎng)與搖瓶培養(yǎng)

將表達載體pET-HEL轉入到大腸桿菌Ε.coliBL21(DE3)中,得到攜帶有pET-HEL的BL21(pET-HEL)菌株,在含100 μg/mL Ampicillin LB(LB/Amp100)固體培養(yǎng)基平板上劃線,37 ℃培養(yǎng)過夜．挑取單菌落接種至LB/Amp100液體培養(yǎng)基,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜,然后按照1∶20比例接種至M9培養(yǎng)基,37 ℃、200 r/min擴增培養(yǎng),直到吸光度A600為0.6～0.8．用于后續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)基的選擇．

1.3 蛋白質表達條件的優(yōu)化

1.3.1 誘導溫度的選擇 取“1.2”所得菌液3管,每管5 mL,加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L,分別于25 ℃、30 ℃、37 ℃,200 r/min誘導6 h,各收集菌液1 mL,離心,棄上清,加入100 μL Loading Buffer,5 μL DTT,80 ℃煮沸5 min,取15 μL進行SDS-PAGE檢測．

1.3.2 誘導劑濃度的選擇 取“1.2”所得菌液6管,每管5 mL,加入IPTG至終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L,于37 ℃、200 r/min誘導培養(yǎng)6 h,各收集菌液1 mL,按照“1.3.1”方法進行樣品處理與分析．

1.3.3 誘導時間的選擇 取“1.2”所得菌液1管15 mL,加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L,于37 ℃、200 r/min誘導培養(yǎng),分別于0、2、4、6、8、10、20 h取樣1 mL,按照“1.3.1”方法進行樣品處理與分析．

1.3.4 HEL的可溶性分析 取誘導培養(yǎng)的菌液10 mL,5 000 r/min離心10 min,棄上清,沉淀反復凍融幾次,加入2 mL裂解液懸浮,超聲裂解,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,分別收集上清和沉淀,加入Loading Buffer與DTT,各取15 μL進行SDS-PAGE分析．

1.4 HEL的大量培養(yǎng)與分離純化

1.4.1 HEL的大量表達以及包涵體的變性與復性 在選定的蛋白質表達條件下,培養(yǎng)菌液1 L,4 ℃、4 500 r/min離心30 min收集菌體,加入50 mL PBS懸浮沉淀,反復凍融3次,離心,棄上清,加入50 mL裂解液(PBS緩沖液,pH值7.0),超聲裂解,離心,棄上清,收集沉淀．將包涵體沉淀用50 mL變性溶液(20 mmol/L Tris,50 mmol/L NaCl,6 mol/L GuHCl,10 mmol/L DTT,pH值7.0)溶解,室溫放置2 h;然后緩慢滴加至500 mL復性溶液(50 mmol/L Tris,5 mmol/L GSH,0.5 mmol/L GSSG,pH值7.0),攪拌,過夜,離心,取上清,0.45 μm微孔濾膜過濾．

1.4.2 Ni柱親和層析分離純化HEL 取復性溶液流穿2 mL Ni柱親和層析液,分別用洗滌液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,2 mmol/L咪唑,pH值8.0)洗滌3～4次,洗脫液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,50 mmol/L咪唑)洗脫6～8次,取15 μL進行SDS-PAGE分析．

1.5 選擇性標記蛋白樣品的表達

按照上述優(yōu)化的最佳實驗條件進行大量表達．1∶20轉至1 L的M9培養(yǎng)基時,加入100 mg的13C6-酪氨酸與50 mg其他19種未標記的氨基酸進行擴增培養(yǎng),至吸光度A600為0.6～0.8時加入0.4 mmol/L IPTG于37 ℃誘導8 h,然后按照上述變復性方法與分離純化條件得到選擇性標記酪氨酸的蛋清溶菌酶．Ni柱純化后的蛋白質進行超濾(3 000 MW),然后用紫外分光光度計測定蛋白濃度．

1.6 選擇性標記HEL的NMR測定分析

1.6.1 NMR樣品的制備 將所得到的蛋白溶液置換至500 μL的氘代乙酸鹽緩沖溶液(pH值3.6)中,然后轉移至5 mmol/L的核磁管中．另取5 mg自然豐度的蛋清溶菌酶溶于500 μL的氘代乙酸鹽緩沖液(pH值3.6),轉至5 mmol/L的核磁管中．

1.6.2 測定NMR譜圖 采用Bruker 600MHz 核磁共振波譜儀測定,儀器探頭為5 mmol/L超低溫探頭,進行1H-13C HSQC譜圖測定．設定的HSQC測定條件為:測定溫度為25 ℃、T1掃描次數(shù)scan為32次,increment為128次．

2 結果與討論

2.1 蛋白表達條件的優(yōu)化

2.1.1 誘導溫度對蛋白表達的影響 質粒pET-15b選用的酶切位點為NdeⅠ和XhoⅠ,構建質粒時含有6個his標簽便于后續(xù)純化,故pET-HEL誘導表達的蛋白分子質量約為16.61 kU,經(jīng)過誘導培養(yǎng)后可見目標蛋白的條帶．培養(yǎng)溫度在25～37 ℃的范圍內,37 ℃蛋白表達量相對最高,后續(xù)實驗均采用37 ℃進行誘導培養(yǎng)(圖2)．

M.蛋白標準Marker; 1.25 ℃; 2.30 ℃; 3.37 ℃

Fig.2 SDS-PAGE pattern of HEL expression at different tem-eratures

2.1.2 誘導濃度對蛋白表達的影響 誘導劑IPTG濃度在0～1.0 mmol/L范圍內,蛋白表達量在0.8 mmol/L時降低,0.2～0.6 mmol/L之間差別不大,選取中間值0.4 mmol/L作為誘導濃度(圖3)．

M.蛋白標準Marker; 1—6為誘導濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1表達組

圖3 不同誘導濃度下HEL表達的SDS-PAGE

Fig.3 SDS-PAGE pattern of HEL expression at different con-centration of inducer

2.1.3 誘導時間對蛋白表達的影響 HEL蛋白表達量開始隨時間延長而增加,到8 h后表達量差異不明顯(圖4),考慮到時間成本,后續(xù)實驗均選擇誘導表達8 h．

M.蛋白標準Marker; 1—7為誘導時間0、2、4、6、8、10、20 h表達組

Fig.4 SDS-PAGE pattern of HEL expression at different time

2.2 HEL的可溶性分析

將菌體超聲上清與沉淀進行SDS-PAGE測定,轉化菌經(jīng)裂解液處理之后,上清中沒有目的蛋白條帶,而在沉淀中出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶,提示表達HEL主要是以包涵體形式進行表達,與文獻一致[16]．說明蛋白質的結構折疊不正確,因此需要進行變復性處理(圖5)．

M.蛋白標準Marker; H.天然HEL； 1.誘導前； 2.誘導后; 3.誘導后； 4.超聲上清； 5.超聲沉淀

圖5 可溶性分析的SDS-PAGE

Fig.5 SDS-PAGE pattern for soluble analysis

2.3 HEL的大量表達與分離純化

按照前期的優(yōu)化條件擴大表達后得到菌體,超聲破碎獲得包涵體,經(jīng)過鹽酸胍變性與稀釋復性之后,將復性溶液過Ni柱進行純化,然后進行SDS-PAGE分析檢測,測定結果顯示:變性上清中含有目標蛋白,Ni柱純化的洗脫液的SDS-PAGE結果顯示純化后得到單一條帶的蛋白帶,而在變性后離心沉淀以及流穿與洗滌液中都沒有目標蛋白條帶的出現(xiàn)(圖6).

M.蛋白標準Marker; H.天然HEL； 1.變性上清； 2.變性沉淀; 3.復性上清； 4.流穿液； 5.洗滌液 6.洗脫液

圖6 Ni柱純化的SDS-PAGE

Fig.6 SDS-PAGE pattern of purified protein through Ni col-umn

2.4 蛋白收率

紫外分光光度法測得蛋白收率為3 mg/L培養(yǎng)基．

2.5 天然與標記狀態(tài)下HEL的NMR譜圖

天然與標記狀態(tài)下HEL的HSQC全譜如圖7所示,圖譜中的橫縱坐標一致,圖7A為天然狀態(tài)下HEL的HSQC譜,圖7B為標記狀態(tài)下HEL的HSQC譜,a部分為烷烴區(qū)域;b部分為芳香環(huán)區(qū)域．由圖7可知,自然豐度下HEL的信號重疊較為嚴重,標記后主鏈區(qū)(A烷烴區(qū)域)信號明顯減少,芳香環(huán)部分的信號只有標記氨基酸的信號．

圖7 天然與標記狀態(tài)下HEL的HSQC全譜

圖8為天然與選擇性標記下HEL的HSQC譜圖的芳香環(huán)部分譜圖．圖中信號主要是酪氨酸的信號,其中c部分為溶劑與緩沖鹽溶液的信號．經(jīng)過信號歸屬,a為酪氨酸α部分的CH信號,b為酪氨酸β部分的CH信號．

圖8 天然與標記狀態(tài)下HEL的HSQC譜圖芳香環(huán)部分

Fig.8 The part of aromatic rings of HSQC spectrum of HEL in natural and labeled state

3 結 論

通過對蛋清溶菌酶(HEL)中酪氨酸(Tyr)進行選擇性標記,闡明了選擇性標記HEL的表達方法,并將利用此法得到的標記的蛋清溶菌酶與天然的蛋清溶菌酶進行HSQC譜圖的比較,結果表明標記的蛋清溶菌酶簡化了核磁譜圖,簡化后Tyr的信號更加清晰,使得核磁信號指認困難的問題得以解決．為將來蛋白質的特殊標記提供了指導意義,同時為未來蛋白質核磁研究中的特殊標記樣品的制備提供了節(jié)約成本與人力的借鑒意義．